Флуоресцентное маркирование GC-богатой ДНК-матрицы различными производными нуклеотидов для гибридизационного анализа на биологическом микрочипе

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Исследована эффективность маркирования GC-богатой области промотора гена TERT в геноме человека пpоизводными 5′-тpифоcфатов 2′-дезокcиуpидина (dU) и 2ʹ-дезоксицитидина (dC), содержащими цианиновые красители Cy5 и Cy7 в качестве флуоресцентной метки. Методом ПЦР в реальном времени оценивали влияние модифицированных нуклеотидов на эффективность ПЦР, также определяли степень включения нуклеотидов в ПЦР-продукт. Эффективность маркирования ДНК-матрицы определяли по интенсивности флуоресцентного сигнала при проведении аллель-специфичной гибридизации на биологическом микрочипе. Наибольший уровень флуоресценции ячеек биочипа наблюдали для производных dU-Cy7 по сравнению с производными dU- и dC-Cy5. В то же время в случае GC-богатой ДНК-матрицы использование производных dC-Cy5 давало принципиально лучший результат по сравнению с производным dU-Cy5. Таким образом, модифицированные аналоги Cy7, способные встраиваться в ДНК при проведении ПЦР, в меньшей степени зависят от GC-состава ДНК-матрицы и выступают более универсальными флуоресцентными метками для диагностических целей. Наиболее перспективным представляется дальнейшее применение модифицированных аналогов Cy7 при разработке тест-систем формата “лаборатория-на-чипе”.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

И. О. Баринова

ФГБУН “Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта” РАН

Email: tanased06@rambler.ru
Россия, 119991 Моcква, ул. Вавилова, 32

В. Е. Шершов

ФГБУН “Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта” РАН

Email: tanased06@rambler.ru
Россия, 119991 Моcква, ул. Вавилова, 32

В. О. Варачев

ФГБУН “Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта” РАН

Email: tanased06@rambler.ru
Россия, 119991 Моcква, ул. Вавилова, 32

С. А. Суржиков

ФГБУН “Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта” РАН

Email: tanased06@rambler.ru
Россия, 119991 Моcква, ул. Вавилова, 32

И. В. Гречишникова

ФГБУН “Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта” РАН

Email: tanased06@rambler.ru
Россия, 119991 Моcква, ул. Вавилова, 32

О. А. Заседателева

ФГБУН “Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта” РАН

Email: tanased06@rambler.ru
Россия, 119991 Моcква, ул. Вавилова, 32

Т. В. Наседкина

ФГБУН “Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта” РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: tanased06@rambler.ru
Россия, 119991 Моcква, ул. Вавилова, 32

А. В. Чудинов

ФГБУН “Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта” РАН

Email: tanased06@rambler.ru
Россия, 119991 Моcква, ул. Вавилова, 32

Список литературы

  1. Stumpf A., Brandstetter T., Hübner J., Rühe J. // PLoS One. 2019. V. 14. P. e0225525. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225525
  2. Dullaert-de Boer M., Akkerman O.W., Vermeer M., Hess D.L.J., Kerstjens H.A.M., Anthony R.M., van der Werf T.S., van Soolingen D., van der Zanden A.G.M. // PLoS One. 2018. V. 13. P. e0190847. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0190847
  3. Ikonnikova A.Y., Filippova M.A., Surzhikov S.A., Pozhitnova V.O., Kazakov R.E., Lisitsa T.S., Belkov S.A., Nasedkina T.V. // Drug Metab. Pers. Ther. 2020. V. 36. P. 33–40. https://doi.org/10.1515/dmpt-2020-0155
  4. Leevy W.M., Gammon S.T., Johnson J.R., Lampkins A.J., Jiang H., Marquez M., Piwnica-Worms D., Suckow M.A., Smith B.D. // Bioconj. Chem. 2008. V. 19. P. 686–692. https://doi.org/10.1021/bc700376v
  5. Шершов В.Е., Иконникова А.Ю., Василисков В.А., Лапа С.А., Мифтахов Р.А., Кузнецова В.Е., Чудинов А.В., Наседкина Т.В. // Биофизика. 2020. Т. 65. С. 865–871. https://doi.org/10.31857/S0006302920050038
  6. Фесенко Д.О., Гусейнов Т.О., Лапа С.А., Кузнецова В.Е., Шершов В.Е., Спицын М.А., Наседкина Т.В., Заседателев А.С., Чудинов А.В. // Мол. биология. 2018. Т. 52. С. 533–542. https://doi.org/10.7868/S0026898418030175
  7. Иконникова А.Ю., Шершов В.Е., Мороз Ю.В., Василисков В.А., Лапа С.А., Мифтахов Р.А., Кузнецова В.Е., Чудинов А.В., Наседкина Т.В. // Биофизика. 2021. Т. 66. С. 31–39. https://doi.org/10.31857/S000630292101004X
  8. Bell R.J., Rube H.T., Xavier-Magalhães A., Costa B.M., Mancini A., Song J.S., Costello J.F. // Mol. Cancer Res. 2016. V. 14. P. 315–323. https://doi.org/10.1158/1541-7786.MCR-16-0003
  9. Фесенко Д.О., Абрамов И.С., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Суржиков С.А., Гречишникова И.В., Барский В.Е., Чудинов А.В., Наседкина Т.В. // Мол. биология. 2018. Т. 52. С. 997–1005. https://doi.org/10.1134/S0026898418060071
  10. Lapa S.A., Volkova O.S., Spitsyn M.A., Shershov V.E., Kuznetsova V.E., Guseinov T.O., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2019. V. 45. P. 263–272. https://doi.org/10.1134/S1068162019040046
  11. Иконникова А.Ю., Лисица Т.С., Шершов В.Е., Спицын М.А., Гусейнов Т.О., Фесенко Д.О., Лапа С.А., Кузнецова В.Е., Заседателев А.С., Чудинов А.В., Наседкина Т.В. // Биофизика. 2017. Т. 62. С. 1093–1098.
  12. Boyer A.E., Lipowska M., Zen J.-M., Patonay G. // Anal. Lett. 1992. V. 25. P. 415–428. https://doi.org/10.1080/00032719208016105
  13. Varachev V.O., Guskov D.A., Shekhtman A.P., Rogozhin D.V., Polyakov S.A., Zacedatelev A.S., Chudinov A.V., Nasedkina T.V. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2023. V. 49. P. 1137–1142. https://doi.org/10.1134/S1068162023050205
  14. Varachev V., Shekhtman A., Guskov D., Rogozhin D., Zasedatelev A., Nasedkina T. // Diagnostics (Basel). 2024. V. 14. P. 200. https://doi.org/10.3390/diagnostics14020200

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
2. Рис. 1. Строение флуоресцентно-меченых аналогов нуклеотидов ряда Cy5 (а) и Cy7 (б).

3. Рис. 2. Эффективность прохождения ПЦР в присутствии различных концентраций флуоресцентно-меченых аналогов нуклеотидов (а) и эффективность встраивания в растущую цепь ДНК (б).

4. Рис. 3. Результаты гибридизационного анализа на биочипе образца с генотипом C/C в позиции –146 C>T промотора TERT для различных флуоресцентно-меченых аналогов нуклеотидов при концентрации 16 мкМ. (а) – Картины гибридизации для фрагмента биочипа, содержащего зонды –146 C и –146 T; (б) – нормированный сигнал флуоресценции от ячеек, содержащих совершенный дуплекс; (в) – дискриминационное отношение (пунктирная линия – пороговое значение, равное 1.5; область, выделенная голубым цветом, включает значения дискриминационного отношения ниже 1.5, при которых невозможно однозначное определение генотипа C/C для данной точки.

Скачать (859KB)

© Российская академия наук, 2025