ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА PAPC НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕЙ Pichia pastoris

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Дрожжи Pichia pastoris (Komagataella phaffii) нашли широкое применение в пищевой и фармацевтической промышленности как микробные клеточные фабрики рекомбинантных белков за способность к гетерологической сверхэкспрессии многих целевых белков, в том числе протеолитических ферментов. Протеаза-активатор протеина С (PAPC) плазмы крови из микромицета Aspergillus ochraceus VKM F-4104D потенциально может быть внедрена в терапевтическую практику в качестве фибринолитического лекарственного средства, а также в диагностические системы для анализа свертываемости крови в роли основного компонента, активирующего протеин С. Для решения задач по применению протеазы-активатора протеина С в медицине и ветеринарии важно иметь надежную систему продукции рекомбинантного фермента. Такая система продукции может быть создана на основе дрожжей. Цель данной работы заключалась в создании штамма-продуцента PAPC на основе дрожжей P. pastoris и демонстрации успешной продукции и секреции протеолитического фермента в культуральную жидкость. Нами был сконструирован вектор, несущий ген papc. Этим вектором были трансформированы дрожжи P. pastoris, проведена селекция трансформантов на среде, содержащей антибиотик зеоцин. При помощи селекции на агаризованной среде с казеином, а также анализа культуральной жидкости методом белкового электрофореза в ПААГ были отобраны наиболее эффективные клоны-продуценты целевого фермента. Исследована динамика накопления активной формы PAPC в культуральной жидкости после индукции белкового синтеза при глубинном культивировании продуцирующего клона в колбе. LC-MS-анализ подтвердил присутствие фермента в культуральной среде, а также показал, что его накопление происходит в зрелой ферментативно активной форме. Полученный в результате работы штамм-продуцент может быть использован для дальнейшего получения экспериментальных промышленных партий фермента на биотехнологических производствах, поддерживающих проведение дрожжевой ферментации.

Об авторах

С. К Комаревцев

ФГБУН ГНЦ "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН

Москва, Россия

Ю. С Лаптева

ФГБУН ФИЦ "Пущинский научный центр биологических исследований РАН", Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН

Пущино, Россия

Р. Х Зиганшин

ФГБУН ГНЦ "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН

Москва, Россия

В. В Фарофонова

ФГБУН ФИЦ "Пущинский научный центр биологических исследований РАН", Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН

Пущино, Россия

В. Н Степаненко

ФГАОУ ВО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздрава России

Москва, Россия

А. А Осмоловский

ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова", биологический факультет

Москва, Россия

К. А Мирошников

ФГБУН ГНЦ "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН; ФГБОУ ВО "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова", биологический факультет

Москва, Россия; Москва, Россия

Е. В Локтюшов

ФГБУН ФИЦ "Пущинский научный центр биологических исследований РАН", Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН

Email: zhenyaloktushov@gmail.com
Пущино, Россия

Список литературы

  1. Banerjee G., Ray A.K. // Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2017. V. 33. P. 119–143. https://doi.org/10.1080/02648725.2017.1408256
  2. Frolova A.S., Chepikova O.E., Deviataikina A.S., Solonkina A.D., Zamyatnin A.A. // Biology (Basel). 2023. V. 12. P. 797. https://doi.org/10.3390/biology12060797
  3. Jabalia N., Chaudhary N. // GSTF J. BioSci. 2015. V. 3. P. 15–19. https://doi.org/10.7603/s40835-014-0005-8
  4. Zhang Y., Huang H., Yao X., Du G., Chen J., Kang Z. // Bioresour. Technol. 2017. V. 247. P. 81–87. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2017.08.006
  5. Ramirez-Larrota J.S., Eckhard U. // Biomolecules. 2022. V. 12. P. 1–19. https://doi.org/10.3390/biom12020306
  6. Osmolovskiy A.A., Kreyer V.G., Baranova N.A., Kurakov A.V., Egorov N.S. // Appl. Biochem. Microbiol. 2013. V. 49. P. 581–586. https://doi.org/10.1134/S0003683813060148
  7. Osmolovskiy A.A., Kreyer V.G., Kurakov A.V., Baranova N.A., Egorov N.S. // Appl. Biochem. Microbiol. 2012. V. 48. P. 488–492. https://doi.org/10.1134/S0003683812050109
  8. Bouwens E.A., Stavenuiter F., Mosnier L.O. // J. Thromb. Haemost. 2013. V. 11. P. 242–253. https://doi.org/10.1111/jth.12247
  9. Mohammed S., Favaloro E.J. // Methods Mol. Biol. 2017. V. 1646. P. 137–143. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7196-1_10
  10. Gempeler-Messina P.M., Volz K., Buhler B., Muller C. // Haemostasis. 2001. V. 31. P. 266–272. https://doi.org/10.1159/000048072
  11. Osmolovskiy A.A., Orekhova A.V., Kreyer V.G., Baranova N.A., Egorov N.S. // Biomed. Khim. 2018. V. 64. P. 115–118. https://doi.org/10.18097/PBMC20186401115
  12. Nasr A.R., Komarevtsev S.K., Baidamshina D.R., Ryskulova A.B., Makarov D.A., Stepanenko V.N., Trizna E.Y., Gorshkova A.S., Osmolovskiy A.A., Miroshnikov K.A., Kayumov A.R. // Biochimie. 2025. V. 230. P. 33–42. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2024.11.002
  13. Komarevtsev S.K., Evseev P.V., Shneider M.M., Popova E.A., Tupikin A.E., Stepanenko V.N., Kabilov M.R., Shabunin S.V., Osmolovskiy A.A., Miroshnikov K.A. // Microorganisms. 2021. V. 9. P. 1–13. https://doi.org/10.3390/microorganisms9091936
  14. Komarevtsev S.K., Popova E.A., Kreyer V.G., Miroshnikov K.A., Osmolovskiy A.A. // Appl. Biochem. Microbiol. 2020. V. 56. P. 32–36. https://doi.org/10.1134/S0003683820010093
  15. Pan Y., Yang J., Wu J., Yang L., Fang H. // Front. Microbiol. 2022. V. 13. P. 1059777. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.1059777
  16. Zhang Q., Wang X., Luo H., Wang Y., Tu T., Qin X., Su X., Huang H., Yao B., Bai Y., Zhang J. // Microb. Cell Fact. 2022. V. 21. P. 112. https://doi.org/10.1186/s12934-022-01837-x
  17. Marillonnet S., Grutzner R. // Curr. Protoc. Mol. Biol. 2020. V. 130. P. 115. https://doi.org/10.1002/cpmb.115
  18. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. // Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd Ed. / Ed. Nolan C. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
  19. Lin-Cereghino J., Wong W.W., Xiong S., Giang W., Luong L.T., Vu J., Johnson S.D., Lin-Cereghino G.P. // Biotechniques. 2005. V. 38. P. 44–48. https://doi.org/10.2144/05381BM04
  20. Schagger H. // Nat. Protoc. 2006. V. 1. P. 16–22. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.4
  21. Looke M., Kristjuhan K., Kristjuhan A. // Biotechniques. 2011. V. 50. P. 325–328. https://doi.org/10.2144/000113672
  22. Shevchenko A., Tomas H., Havlis J., Olsen J.V., Mann M. // Nat. Protoc. 2006. V. 1. P. 2856–2860. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.468
  23. Rappsilber J., Mann M., Ishihama Y. // Nat. Protoc. 2007. V. 2. P. 1896–1906. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.261
  24. Ma B., Zhang K., Hendrie C., Liang C., Li M., Doherty-Kirby A., Lajoie G. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003. V. 17. P. 2337–2342. https://doi.org/10.1002/rcm.1196
  25. Anson M.L. // Science. 1935. V. 81. P. 467–468. https://doi.org/10.1126/science.81.2106.467
  26. Hagihara B., Matsubara H., Nakai M., Okunuki K. // J. Biochem. 1958. V. 45. P. 185–194. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a126856

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Российская академия наук, 2025