Экспрессия фарнезилированного EGFP в нейронах первичной культуры неокортекса приводит к нарушению развития дендритных шипиков

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Генетически кодируемые флуоресцентные белки широко используются в биологических исследованиях вообще и в нейробиологии в частности. При использовании этих инструментов важно, чтобы экспрессия флуоресцентного белка не нарушала протекание естественных физиологических процессов в клетке. Добавление мотива фарнезилирования к флуоресцентным белкам приводит к их заякориванию в плазматической мембране, что часто используется для визуализации тонких деталей морфологии клетки, например дендритных шипиков. В нашей работе мы исследовали развитие шипиков в первично культивируемых нейронах неокортекса при трансфекции клеток фарнезилированным и немодифицированным EGFP методом электропорации в суспензии в день посадки. Было обнаружено, что нейроны, экспрессирующие фарнезилированный EGFP, демонстрируют выраженные нарушения в развитии шипиков, в частности эти клетки характеризовались более длинными шипиками с большим количеством филоподия-подобных структур, что характерно для различных патологических состояний. Поэтому при использовании фарнезилированных флуоресцентных белков в экспериментах необходимо учитывать их возможное негативное влияние на развитие различных мембранных структур клетки, в частности нейрональных шипиков.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Г. Р. Смирнова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Email: malyshev@ihna.ru
Россия, Москва

О. С. Иджилова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Email: malyshev@ihna.ru
Россия, Москва

А. Абонакур

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Email: malyshev@ihna.ru
Россия, Москва

А. Ю. Малышев

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: malyshev@ihna.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. Day R.N., Davidson M.W. // Chem. Soc. Rev. 2009. V. 38. P. 2887–2921.
  2. Cranfill P.J., Sell B.R., Baird M.A., Allen J.R., Lavagnino Z., de Gruiter H.M., Kremers G.-J., Davidson M.W., Ustione A., Piston D.W. // Nat. Methods. 2016. V. 13. P. 557–562.
  3. Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S. // Gene. 1996. V. 173. P. 33–38.
  4. Kostyuk A.I., Demidovich A.D., Kotova D.A., Belousov V. V, Bilan D.S. // Int. J. Mol. Sci. 2019. V. 20. P. 4200.
  5. Craven S.E., El-Husseini A.E., Bredt D.S. // Neuron. 1999. V. 22. P. 497–509.
  6. Grabrucker A.M., Vaida B., Bockmann J., Boeckers T.M. // J. Neurosci. Methods. 2009. V. 181. P. 227–234.
  7. Cane M., Maco B., Knott G., Holtmaat A. // J. Neurosci. 2014. V. 34. P. 2075–2086.
  8. Lim S.T., Antonucci D.E., Scannevin R.H., Trimmer J.S. // Neuron. 2000. V. 25. P. 385–397.
  9. Kitamura A., Nakayama Y., Kinjo M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2015. V. 463. P. 401–406.
  10. Lu J., Wu T., Zhang B., Liu S., Song W., Qiao J., Ruan H. // Cell Commun. Signal. 2021. V. 19. P. 60.
  11. Амая М., Айзенхабер Б., Айзенхабер Ф., ван Хук М.Л. // Молекулярная биология. 2013. Т. 47. С. 717–730.
  12. Kim A.K., Wu H.D., Inoue T. // Sci. Rep. England, 2021. V. 11. P. 16421.
  13. Watts S.D., Suchland K.L., Amara S.G., Ingram S.L. // PLoS One. 2012. V. 7 P. e35373–e35373.
  14. Rodgers W. // Biotechniques. 2002. V. 32 P. 1044–1051.
  15. Keiser M.S., Chen Y.H., Davidson B.L. // Curr. Protoc. Mouse Biol. 2018. V. 8. e57
  16. Yuste R. Dendritic Spines. The MIT Press, 2010.
  17. Son J., Snng S., Lee S., Chang S., Kim M. // J. Microsc. 2011. V. 241. P. 261–272.
  18. Hayashi Y., Majewska A.K. // Neuron. 2005. V. 46. P. 529–532.
  19. Bourne J., Harris K.M. // Curr. Opin. Neurobiol. 2007. V. 17. P. 381–386.
  20. Fiala J.C., Feinberg M., Popov V., Harris K.M. // J. Neurosci. 1998. V. 18. P. 8900–8911.
  21. Wisniewski K.E., Segan S.M., Miezejeski C.M., Sersen E.A., Rudelli R.D.// Am. J. Med. Genet. 1991. V. 38. P. 476–480.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Морфология дендритных шипиков. а – Схематическое изображение шипика с отображенными параметрами, которые использовались для отнесения шипика к одному из четырех морфологических типов: грибовидный, пенек, тонкий и филоподия. б – Конфокальная микрофотография, демонстрирующая фрагмент дендрита пирамидного нейрона неокортекса мыши, трансдуцированного in vivo адено-ассоциированным вирусом, несущим фарнезилированный EGFP. Калибровка 2 мкм.

Скачать (210KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Культивируемые нейроны, трансфицированные фарнезилированным EGFP, демонстрируют выраженные аномалии развития по сравнению с клетками, экспрессирующими немодифицированный EGFP. а, б – фрагменты дендритов нейронов, экспрессирующих fEGFP (а) и EGFP (в). Стрелками с буквами обозначены примеры шипиков, отнесенных к тому или иному морфологическому классу: Ф – филоподия, Г – грибовидный, П – пенькообразный, Т – тонкий. б, г – тела клеток, трансфицированных плазмидой с fEGFP (б) и EGFP (г). Калибровка 5 мкм.

Скачать (401KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Иммунохимическое окрашивание нейронов, экспрессирующих EGFP и fEGFP, антителами к синаптическим белкам. а, б – Фрагменты дендритов нейронов, экспрессирующих EGFP (а) и fEGFP (б) (зеленое), окрашенные антителами к пресинаптическому белку синаптофизину (красное). Стрелками отмечены некоторые шипики, у которых головка соседствует с иммуноположительной меткой. в, г – Нейроны, трансфицированные плазмидами с EGFP и fEGFP, окрашенные антителами к постсинаптическому белку PSD95 (красное). Стрелками отмечены совпадения иммунореактивной метки с головкой шипика. Калибровка 5 мкм.

Скачать (890KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Скрипичные диаграммы, демонстрирующие распределения величин различных характеристик шипиков в нейронах, экспрессирующих EGFP и fEGFP. Толстая пунктирная линия показывает медиану, точечные линии – первые квартили. а – Длина шипиков; б – количество шипиков данного морфологического типа или колокализованных с иммунохимической меткой к синаптическому белку в процентах по отношению к общему количеству проанализированных шипиков; правая ось ординат. * – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001; n.s. – различия недостоверны, критерий Стьюдента с поправкой Холма–Бонферони.

Скачать (283KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025