Коррекция молекулярным водородом метаболических и структурных нарушений в сперматозоидах быков при криоконсервации

Полный текст

Уровень воспроизводства в животноводстве определяется количественными и качественными показателями спермы быков. [3, 4] Большое теоретическое и практическое значение имеет изучение ее способности к криоконсервации.

Многочисленными исследованиями установлено, что процесс замораживания вызывает неблагоприятные изменения в половых клетках, их повреждение или полную гибель. [2] Технология сохранения гамет позволяет получить примерно 50% живых сперматозоидов после оттаивания. [17]

Причина гибели спермиев при криоконсервации – затвердевание воды, которой в сперме содержится примерно 90%. Образовавшие кристаллы льда разрушают структуру протоплазмы и ядра сперматозоидов. При охлаждении лед появляется изначально в жидкой фазе спермы, в результате растворенные в ней сахара и соли образуют гипертонические растворы, под действием которых сперматозоиды обезвоживаются. [8, 17]

Совершенствование протоколов криоконсервации спермы помоголо бы решить множество проблем, связанных со снижением ее качества после оттаивания. [12, 13]

Молекулярный водород относится к группе соединений, тормозящих на клеточном уровне свободнорадикальные процессы, повышающих активность антиоксидантной системы, усиливающих метаболизм, восстанавливающих структуру клеточных мембран. Он может положительно повлиять на морфологические и функциональные показатели сперматозоидов. [9, 10]

Решающее значение для определения оптимальной функции спермы имеет прогрессивная подвижность сперматозоидов. [15, 16] Для ее поддержания на необходимом для оплодотворения уровне требуются затраты АТФ. [11, 14]

Цель работы – изучить влияние молекулярного водорода на функциональный статус нативных и деконсервированных сперматозоидов быков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В ООО «Нижегородское» (Кстовский муниципальный район Нижегородской области) исследовали in vitro сперму черно-пестрых голштинизированных быков. Сбор проводили у животных в возрасте трех лет в соответствии с национальной технологией замораживания и использования спермы племенных быков-производителей. Взято около 150 эякулятов с подвижностью сперматозоидов более 7 баллов и минимальным количеством аномальных форм клеток.

Сперму разбавляли стерильной средой BioXcell (Франция). Для изучения влияния молекулярного водорода на сперматозоиды быков BioXcell разводили водородной водой. Затем осуществляли итоговое разбавление, фасовку и эквилибрацию (экспозиция при 4°С в течение трех-четырех часов). Сперматозоиды замораживали в открытых гранулах по 0,2 мл (ГОСТ 26030-2015) в течение 7,5 мин. до температуры минус 145°С, затем контейнер с образцами помещали в жидкий азот (минус 196°С).

После окончания семидневного карантина семя размораживали по стандартной технологии.

Освобождали сперматозоиды от семенной плазмы отмывая ее физиологическим раствором, дважды центрифугируя по 10 мин. при 400g, надосадочную жидкость сливали. Осадок суспендировали в 1 мл физиологического раствора. Лизис сперматозоидов проводили трехкратным замораживанием/оттаиванием. Затем образцы центрифугировали 5 мин. при 2500g.

Для насыщения воды молекулярным водородом использовали герметический бокс, в котором давление водорода повышали до 4 атм. в течение нескольких часов. Пакет выдерживали при атмосферном давлении в замкнутом объеме для того, чтобы избежать выделения водорода в виде микропузырьков и обратной его диффузии через стенки пакета. Концентрация молекулярного водорода в растворе – 1,2…5 мг/л.

Исследовали нативную сперму, разбавленную BioXcell (группа I), нативную разбавленную BioXcell с молекулярным водородом (II), сперму после криоконсервации (III) и после глубокой заморозки, предварительно обработанную молекулярным водородом (IV).

Определяли качественные показатели фертильности сперматозоидов на спермоанализаторе SA-500 «Биола» (Россия) и содержание в них АТФ методом И.Л. Виноградовой с соавторами. [1]

Полученные данные обрабатывали в программе Microsoft Excel. Результаты анализировали по параметрическому t-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Нативные эякуляты имели 82,51±5,95% подвижных сперматозоидов. После криоконсервации 71,15±4,34% из них были протестированы как подвижные (см. таблицу).

 

Влияние молекулярного водорода на показатели фертильности и внутриклеточное содержание АТФ в сперматозоидах быков, М±m

Критерий фертильности сперматозоидов	Нативные разбавленные сперматозоиды		Сперматозоиды после
	группа I	после воздействия молекулярным водородом (группа II)	криоконсервации (группа III)	воздействия молекулярным водородом и криоконсервации (группа IV)
Подвижность, %	82,51±5,95	79,81±5,55	71,15±4,34*	79,62±3,60* ∆
Количество подвижных, млн/доза	35,76±6,17	36,67±6,12	27,35±5,16*	33,71±6,03* ∆
Количество быстрых, млн/доза	65,54±7,14	66,32±6,72	51,77±6,13*	58,98±6,55* ∆
Количество медленных, млн/доза	45,37±4,17	43,27±4,45	46,38±4,44	41±3,96 ∆
Средняя скорость движения, мкм/сек.	85,62±3,54	83,27±4,47	74,53±2,48*	81,56±3,52* ∆
Содержание АТФ, мкмоль/л	0,79±0,09	0,75±0,12	0,28 ±0,05*	0,47±0,04* ∆

Примечание. среднее ± SEM, «*» – статистически значимые различия по отношению к группе I, р≤0,05; «∆» – статистически значимые различия между группами после криоконсервации (группы III и IV), р≤0,05.

 

Приведенные в таблице экспериментальные данные показывают, что в нативной сперме количество подвижных сперматозоидов составило в среднем 35,76±6,17 млн/доза, быстрых – 65,54±7,14 и медленных – 45,37±4,17, после криоконсервации подвижных сперматозоидов было в среднем 27,35±5,16, быстрых – 51,77±6,13 и медленных – 46,38±4,44 млн/доза.

Скорость движения сперматозоидов – один из наиболее информативных показателей качества спермы. Исследования ученых на замороженно-оттаянной сперме крупного рогатого скота подтверждают, что значительную связь с оплодотворяющей способностью имеет не подвижность сперматозоидов, а скорость их движения. [5] В ходе проведенных экспериментов произошло снижение скорости движения сперматозоидов после замораживания с 85,62±3,54 до 74,53±2,48 мкм/сек (р ≤ 0,05).

Известно, что концентрация АТФ в сперматозоидах положительно коррелирует с оплодотворяющей способностью. [6, 14] Согласно полученным данным, в оттаявших сперматозоидах концентрация АТФ ниже, чем в нативных. До замораживания содержание АТФ в сперматозоидах – 0,79±0,09 мкмоль/л, после оттаивания – 0,28 ±0,05 мкмоль/л.

По результатам исследований установлено, что при глубоком замораживании спермы быков черно-пестрой породы в сперматозоидах наблюдаются изменения фертильных показателей и биохимических процессов, связанных с генерацией энергии.

Добавление молекулярного водорода в среду для разбавления спермы и последующая заморозка изменяло функциональный статус клеток после размораживания, приводило к увеличению их подвижности, повышению количества подвижных и быстрых сперматозоидов, снижению числа медленных клеток относительно анализируемых показателей регенеративных клеток после криоконсервации, не подвергшихся воздействию молекулярного водорода. Подвижность сперматозоидов после оттаивания была выше на 12%, средняя скорость движения – 9%, содержание АТФ – в два раза, чем в образцах спермы, не обработанных молекулярным водородом.

Результаты экспериментов показали, что добавление молекулярного водорода в состав разбавителя спермы улучшает биологические показатели качества спермы быков, ее фертильность, повышает энергетический метаболизм сперматозоидов.

Положительное влияние молекулярного водорода на метаболические и структурные показатели сперматозоидов возможно обусловлено антиоксидантными свойствами молекулярного водорода. [7, 9, 10] Известно, что в процессе криоконсервации в сперматозоидах происходит накопление супероксидных радикалов, что приводит к повреждению ДНК, белков, липидов, развитию окислительного стресса. [4, 5]

На основании проведенной работы можно заключить, что добавление молекулярного водорода в среду для замораживания спермы быков повышает биологическую полноценность сперматозоидов.

Об авторах

Марина Николаевна Иващенко

ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет имени Н.И. Лобачевского»; ФГБОУ ВО «Нижегородский государственный агротехнологический университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: kafedra2577@mail.ru

кандидат биологических наук

Россия, Нижний Новгород; Нижний Новгород

Анна Вячеславовна Дерюгина

ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет имени Н.И. Лобачевского»

Email: kafedra2577@mail.ru

доктор биологических наук

Россия, Нижний Новгород

Андрей Александрович Белов

ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет имени Н.И. Лобачевского»; ФГБОУ ВО «Нижегородский государственный агротехнологический университет»

Email: kafedra2577@mail.ru

кандидат биологических наук

Россия, Нижний Новгород; Нижний Новгород

Михаил Иванович Латушко

Производственное объединение «Уральский оптико-механический завод имени Э.С. Яламова»

Email: kafedra2577@mail.ru

кандидат технических наук

Россия, Екатеринбург

Павел Сергеевич Игнатьев

Производственное объединение «Уральский оптико-механический завод имени Э.С. Яламова»

Email: kafedra2577@mail.ru

кандидат физико-математических наук

Россия, Екатеринбург

Алексей Иванович Ерзутов

ФГБОУ ВО «Нижегородский государственный агротехнологический университет»

Email: kafedra2577@mail.ru

аспирант

Россия, Нижний Новгород

Михаил Сергеевич Лодяной

ФГБОУ ВО «Нижегородский государственный агротехнологический университет»

Email: kafedra2577@mail.ru

кандидат биологических наук

Россия, Нижний Новгород

Список литературы

Дополнительные файлы