Assessment of the toxic effect of the medical glue «Sulfacrylate» in M-22 cell culture

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время основным способом соединения тканей в хирургии является фиксация швами. Продолжается поиск и разработка методик бесшовного, клеевого соединения тканей в ходе хирургических вмешательств, создаются современные клеевые композиции различного физико-химического состава [1]. Широко применяются медицинские тканевые адгезивы на основе цианакрилата. Критически важными параметрами для цианокрилатных клеев являются скорость полимеризации, эластичность и отсутствие токсического эффекта [2, 3]. В нашей стране был разработан, разрешён для применения в различных областях медицины сульфакрилатный медицинский клей на основе этил-α-цианакрилата (связующий компонент), бутилакрилата (пластификатор) и сульфоланметакрилата (противовоспалительный, антимикробный компонент). Клей полимеризуется в течение 10–120 секунд при контакте с водными растворами или живой тканью и резорбируется примерно через 30-45 дней после нанесения. Фрагментация клеевой плёнки происходит за счёт быстрого рассасывания низкомолекулярной части и образования в ней пор (Инструкция по применению медицинского изделия «Клей медицинский «Сульфакрилат», ТУ 9398-063-03533913-2010; регистрационное удостоверение на медицинское изделие № ФСР 2010/09805 от 31.12.2010).

На данный момент сульфакрилатный клей используется в общей и сосудистой хирургии, в травматологии, челюстно-лицевой хирургии, торакальной и абдоминальной хирургии и стоматологии [4–6]. В офтальмологии показана эффективность сульфакрилатного клея при хирургии прогрессирующей миопии и эписклеральной хирургии отслойки сетчатки [7, 8]. Описан случай применения цианоакрилатного клея в хирургическом лечении перфорации роговицы [9]. Тем не менее применение сульфакрилатного клея в пластической офтальмохирургии требует оптимизации, в частности, определение допустимых объёмов клея в расчёте на единицу поверхности ткани. Нет однозначных данных о влиянии сульфакрилатного клея на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток человека in vivo и in vitro. Объективно оценить токсическое действие клея на клетки человека in vitro можно с помощью морфофункциональных методик исследования.

Цель. Оценить токсический эффект медицинского клея «Сульфакрилат» в культуре клеток человека in vitro для оценки возможности применения и оптимальной дозировки клея в пластической офтальмохирургии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Все исследования in vitro проводили на культуре фибробластов человека линии М-22 20-го пассажа. В работе использовали медицинский клей «Сульфакрилат» (ТУ 9398-063-03533913-2010, регистрационное удостоверение на медицинское изделие № ФСР 2010/09805 от 31.12.2010). Для фиксации клея использовали лиофилизированную повязку на основе коллагена 1 типа человека. Из коллагеновой повязки вырезали фрагменты площадью 0,25 см² и наносили на них жидкий клей объёмом 1, 2 и 3 мкл. После полимеризации клея фрагменты повязок помещали в лунки четырёхлуночного планшета с площадью ростовой поверхности 1,9 см². В контрольные лунки фрагменты повязок с клеем не вносили. Для оценки адгезивности исходных коллагеновых повязок в некоторые из контрольных лунок помещали коллагеновые повязки, не содержащие клея. В контрольные и опытные лунки вносили по 10 тыс. клеток в модифицированной среде Dulbecco’s Modified Eagle Medium (ДМЭМ), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки инкубировали в течение 3 суток при температуре 37°С и 5% концентрации СО₂ в атмосфере. Исследование жизнеспособности клеток проводили с помощью метода морфофункциональной оценки клеточного компонента биотрансплантатов, который включает витальное (прижизненное) окрашивание клеток с последующим их анализом в люминесцентном микроскопе [10]. В работе использовали конфокальный люминесцентный микроскоп Nikon 80i (Nikon, Япония), совмещённый с флуоресцентной лампой. Для витального окрашивания клеток использовали флуоресцентный краситель на основе трипафлавина-родамина С. Оценивали общее количество клеток на дне лунок, плотность клеток на дне лунок и на коллагеновых повязках (тыс/см²), структурную целостность клеток и их морфологию, целостность клеточных мембран (ЦКМ). Параметр ЦКМ определяли по яркости витально окрашенных клеток, в норме он составляет 28–42 фут-кандел. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью методов вариа- ционной статистики с использованием пакета программ «IBM SPSS Statistics 22». Вычисляли средние арифметические значения (M), среднеквадратичные отклонения (σ). Для оценки различий использовали t-критерий Стьюдента. Проверку распределения на нормальность проводили с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Различия значений считали достоверными при уровне значимости более 95% (р <0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В контрольных лунках фибробласты человека линии М-22 активно пролиферировали как на дне лунок (рис. 1, a,'a'), так и на поверхности коллагеновых повязок без клея «Сульфакрилат» (рис. 2, a). Через 3 суток плотность клеток составляла в среднем 122 тыс/см² на дне лунок и 48 тыс/см² на коллагеновых повязках. Напротив, на коллагеновых повязках с клеем «Сульфакрилат» адгезия и рост фибробластов полностью отсутствовали (рис. 2, b). Через 3 суток культивирования в опытных лунках около фрагментов коллагеновых повязок с клеем определялись зоны, полностью свободные от клеток (рис. 1, b, b'). По периферии таких зон располагались клетки с выраженными изменениями мембран, клетки истонченной формы (узкие веретеновидные клетки), клетки с морфологическими признаками апоптоза (рис. 1, b'). В то же время ширина таких участков была незначительной и не превышала 50–100 мкм. Вплотную к зоне с повреждёнными клетками можно было выявить центры активного роста клеток (рис. 1, b).

 

Рис. 1. Фибробласты человека линии М-22 через 3 суток культивирования в отсутствии (а, а') и в присутствии (b, b') клея «Сульфакрилат» (2 мкл на коллагеновой повязке площадью 0,25 см²); витальное окрашивание трипафлавином-родамином С: a, b — увеличение х40; a', b' — увеличение х200. Граница коллагеновых повязок с клеем «Сульфакрилат» показана пунктирной линией. Стрелкой показаны центры активного роста клеток М-22.

Fig. 1. Human fibroblasts of the M-22 line after 3 days of cultivation in the absence of (a, a') and in the presence of (b, b') Sulfacrylate glue (2 µkl on a 0.25 cm² collagen bandage), vital staining with tripaflavin–rhodamine C: a, b — increase in x40; a', b' — increase in x200. Dotted line: border of collagen dressings with Sulfacrylate glue; arrow: the centers of active growth of M-22 cells.

 

Рис. 2. Выявление фибробластов человека линии М-22 на поверхности коллагеновых повязок через 3 суток культивирования. Витальное окрашивание трипафлавином-родамином С, увеличение х40: a — повязки без клея «Сульфакрилат», b — повязки с клеем «Сульфакрилат» (2 мкл клея на коллагеновой повязке площадью 0,25 см²).

Fig. 2. Detection of human fibroblasts of the M-22 line on the surface of collagen dressings after 3 days of cultivation. Vital staining with tripaflavin–rhodamine C, increase x40: a — bandages without Sulfacrylate glue; b — bandages with Sulfacrylate glue (2 µl of glue on a 0.25 cm² collagen bandage).

 

Во всех остальных частях опытных лунок клетки имели нормальную морфологию и формировали конфлюэнтный монослой. В присутствии коллагеновых повязок с 1 мкл клея общее число клеток в опытных лунках было снижено по сравнению с контролем на 11%, с 2 мкл клея — на 25%, с 3 мкл клея — на 26% (табл. 1). Во всех опытах клетки имели нормальные значения ЦКМ на фоне снижения общего количества клеток в лунке. Стоит отметить, что уменьшение числа клеток в опытных лунках было обусловлено наличием на дне неадгезивного матрикса, на котором отсутствовала адгезия и миграция клеток. Вместе с тем токсический эффект коллагеновых повязок с клеем «Сульфакрилат» был ограничен размерами повязки, не влиял на жизнеспособность клеток, непосредственно не контактирующих с повязками, и не вызывал выраженного снижения пролиферативной активности клеток в целом.

 

Таблица 1. Зависимость сохранности клеток в культуре фибробластов от объёма использованного клея «Сульфакрилат»

Table 1. Cell safety depending on fibroblast culture on the volume of Sulfacrylate glue used

Объём нанесенного клея The volume of the applied glue	Общее число клеток на дне лунки, тысяч (абс.) Total number of cells at the bottom of the well, thousands (abs.)	Плотность клеток на дне лунок, тыс/см2 Cell density at the bottom of the wells, thousand/cm2	Целостность клеточных мембран, баллы Integrity of cell membranes, points
Контроль (без клея) Control (without glue)	232±12	122±5	35±2
1 мкл	207±9*	109±8*	35±2
2 мкл	174±16*	92±6*	34±3
3 мкл	172±14*	91±8*	34±2

* достоверно относительно контроля при р <0,05

* significantly relative to the control at p <0.05

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Клей «Сульфакрилат» является химически активным веществом и способен вызывать определённое повреждение тканей при непосредственном контакте. Гистологические исследования при выполнении окклюзии вен показывают, что при введении клея «Сульфакрилат» в ткани вен наблюдается развитие контактного некроза с последующей активной воспалительной реакцией с последующей облитерацией просвета вен и склеиванием их стенок [11]. При контакте с клеем и его полимерными конструкциями некротические клетки выявляются в течение 7–30 суток, при этом зона некроза является чётко локализованной и ограничена лишь областью, где расположен полимеризированный клей [11–13]. Резорбция клея в тканях начинается через 30 суток и не препятствует миграции фибробластов и других клеток, росту грануляционной ткани [11–15]. С другой стороны, при использовании больших объёмов клея полимерные конгломераты сохраняются в тканях и через 90–120 суток после введения клея, без выраженного повреждения клеток и межклеточного матрикса [11–13]. Проведённое нами исследование подтверждает данные о том, что определённый токсический эффект клея «Сульфакрилат» сохраняется после его полимеризации даже при использовании минимально возможных объёмов (1–3 мкл). Снижение общего числа клеток in vitro напрямую зависело от объёма клея, присутствующего в лунках с клетками. Таким образом, при проведении клинических работ рекомендуется минимизировать объём используемого адгезива. Согласно инструкции, расход медицинского клея «Сульфакрилат» для устойчивой фиксации всей площади ткани составляет около 0,03 мл на 1 см². Для фиксации тканей, не подверженных значительному механическому воздействию, достаточно использования минимального объёма клея, в зависимости от цели его применения и площади склеиваемых поверхностей [7, 8]. Поскольку для лечения глазной поверхности (фиксация лоскута конъюнктивы) необходимо минимальное количество клея (1–3 мкл), то именно эти дозировки представляются наиболее оптимальными и при хирургическом лечении глазной поверхности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Медицинский клей «Сульфакрилат» не вызывает массовой гибели фибробластов человека и выраженного снижения их пролиферативной активности in vitro. В культуре клеток токсический эффект клея «Сульфакрилат» носит локальный характер и наблюдается в зоне непосредственного контакта клеток с клеем. Для применения в пластической офтальмохирургии объём клея «Сульфакрилат» следует использовать минимальные дозировки (1–3 мкл).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: И.А. Филатова — разработка концепции, окончательное утверждение рукописи для публикации; О.В. Солдаткина — сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи; М.С. Макаров — проведение исследования in vitro, интерпретация данных, редактирование; Н.В. Боровкова — научное редактирование, разработка концепции; М.В. Сторожева — проведение исследования in vitro, интерпретация данных, редактирование; И.Н. Пономарев — интерпретация данных, редактирование статьи.

ADDITIONAL INFO

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution. Аll authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. The largest contribution is distributed as follows: Irina A. Filatova — development of the concept, final approval of the manuscript for publication; Olesya V. Soldatkina — collection and analysis of literary sources, writing and editing of the article; Maxim S. Makarov — in vitro research, data interpretation, editing; Natalya V. Borovkova — scientific editing, concept development; Maya V. Storozheva — in vitro research, data interpretation, editing; Ivan N. Ponomarev — data interpretation, article editing.

About the authors

Irina A. Filatova

Helmholtz National Medical Research Center for Eye Diseases

Email: filatova13@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5449-4980
SPIN-code: 1797-9875

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Moscow

Olesya V. Soldatkina

Helmholtz National Medical Research Center for Eye Diseases

Author for correspondence.
Email: olesya.sold@mail.ru

MD, graduate student

Russian Federation, Moscow

Maxim S. Makarov

N.V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine

Email: makarovms@sklif.mos.ru
SPIN-code: 3543-5800

MD, researcher

Russian Federation, Moscow

Natalya V. Borovkova

N.V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine; Russian Medical Academy of Continuous Professional Education; Pirogov Russian National Research Medical University

Email: borovkovanv@sklif.mos.ru
ORCID iD: 0000-0002-8897-7523
SPIN-code: 9339-2800

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow; Moscow; Moscow

Maya V. Storozheva

N.V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine

Email: mayya.storozheva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1927-2404
SPIN-code: 7789-3277

MD, researcher

Russian Federation, Moscow

Ivan N. Ponomarev

N.V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine

Email: rzam@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2523-6939
SPIN-code: 4705-9314

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files