Role of studying the pathogenesis of retinopathy of prematurity in optimizing disease screening

Full Text

Ретинопатия недоношенных (РН) остаётся одной из ведущих причин слепоты и слабовидения у детей во всем мире, несмотря на разработку и активное применение современных стандартов диагностики и лечения данной патологии и достижения современной неонатальной службы [1]. В определённой степени ретинопатия проявляется даже как следствие этих достижений медицины, поскольку особенно тяжёлые «неклассические» формы заболевания, резистентные к существующим методам лечения, развиваются именно у выхаживаемых и выживающих сегодня глубоко недоношенных детей [2]. Помимо вопросов повышения эффективности лечения и профилактики таких форм патологии, очень важной задачей, призванной снизить частоту инвалидизации вследствие РН, является совершенствование существующей системы скрининга с целью его объективизации и оптимизации с экономической точки зрения.

В настоящее время система скрининга РФ предусматривает осмотр глазного дна всех недоношенных детей, рождённых до 35 недель гестации или с весом менее 2000 г (международные критерии: гестационный возраст при рождении до 32 недель и вес менее 1500 г), с первым осмотром, как правило, в возрасте 4–6 недель жизни. Последующие обследования осуществляются с конкретно установленной, зависящей от клинической картины периодичностью до полного завершения процесса васкуляризации сетчатки либо до развития так называемой «пороговой» стадии РН при классическом её развитии, I типа РН либо задней агрессивной РН (ЗАРН), требующих лечебного вмешательства [3]. Таким образом, мониторинг РН предполагает проведение многократных осмотров глазного дна, оказывающих стрессовое действие на детей и приводящих к большой рабочей нагрузке врача-офтальмолога. Такая система мониторинга имеет очевидные организационно-экономические недостатки, поскольку формы РН, требующие проведения лечебного вмешательства, развиваются не более чем у 10% детей группы риска [4]. Вместе с тем эффективный скрининг недоношенных детей, находящихся в группе риска развития РН, очень важен для адекватной тактики ведения пациентов с РН, поскольку своевременно проведённое лечение приводит к улучшению функциональных исходов заболевания.

Одним из возможных способов оптимизации профилактических осмотров является внедрение телемедицинских технологий с привлечением среднего медицинского персонала для получения изображений глазного дна недоношенных детей. Последующий анализ полученных снимков может выполняться как специально подготовленными специалистами не офтальмологами, так и с привлечением квалифицированных офтальмологов в спорных диагностических случаях [5–7]. Кроме этого, достаточно активно ведётся поиск клинических и лабораторных критериев прогнозирования развития и характера течения РН [8–11]. Фундаментальные исследования в данном аспекте играют ключевую роль. Целостная работа по изучению патогенеза РН должна включать оценку как местных, так и системных факторов. В офтальмологии клинические исследования системных механизмов развития различной патологии являются относительно доступными, например, путём оценки показателей биохимического и клинического анализов крови, системного иммунологического статуса пациента и др. Однако изучение местных факторов патогенеза встречает естественные ограничения в связи с высоким риском, а зачастую невозможностью проведения инвазивных процедур с целью получения биоматериала для исследований. Большое значение здесь приобретают экспериментальные исследования, позволяющие существенно расширить возможности анализа молекулярных участников патологического процесса in situ.

Цель. Определение новых перспективных лабораторных критериев скрининга и прогнозирования характера течения ретинопатии путём углублённого изучения молекулярных участников патогенеза заболевания.

Материал и методы

Проведено комплексное клинико-экспериментальное исследование, включающее оценку местного и системного уровня 49 цитокинов различного биологического действия, четырёх моноаминов и ангиотензина-II (АТ-II) (одного из важнейших компонентов ренин- ангиотензиновой системы) на разных этапах развития патологического процесса [12–18]. В клинической части обследовано 165 недоношенных детей группы риска развития РН. Экспериментальная часть выполнена на 145 крысятах породы Вистар в разработанной нами модели экспериментальной РН (ЭРН). Важно отметить, что для решения обозначенной задачи оптимизации скрининга РН особо значимым для нас было выяснение патогенетического значения изучаемых биологически активных агентов именно на ранних доклинических стадиях, т.е. до начала патологической васкуляризации (на сроке существования аваскулярных зон) и на этапе её индукции. При рассмотрении результатов нашей работы в данной статье мы сделали акцент именно на эти сроки.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы IBM SPSS Statistics (версия 22) и статистического пакета Microsoft Excel. Исследуемые выборки были проверены на соответствие нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для определения статистической значимости полученных результатов был использован непараметрический U-критерий Манна-Уитни (U-тест). Различия считали статистически значимыми при p <0,05. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (mean±SE).

Результаты

Из 49 изучаемых цитокинов и ростовых факторов у всех детей определялся только 21, а именно: IL-2, IL-18, IL-7, Eotaxin, GRO-α, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1β, IL-1RA, LIF, BDNF, VEGF-A, GRO-α, HGF, PDGF-BB, SCF, SDF-1α, TGF-β1, IGF-I, IGF-II. При этом, количественный анализ их содержания в сыворотке крови недоношенных детей с различным прогнозом развития РН позволил выделить 7 наиболее перспективных потенциальных лабораторных маркёров развития и неблагоприятного течения РН. До манифестации заболевания мы выявили более высокий уровень MCP1 (Monocyte Chemoattractant Protein 1 — Моноцитарный хемотаксический белок 1) и IGF-II (Insulin-like Growth Factor — инсулиноподобный фактор роста), более низкий уровень TGFβ1 (Transforming Growth Factor-β — трансформирующий фактор роста-β) и IGF-I у детей с последующим неблагоприятным течением РН по сравнению с детьми, у которых РН не развилась. Кроме того, на начальных стадиях развития заболевания уровень VEGF-A (Vascular Endothelial Growth Factor — фактор роста эндотелия сосудов), TGFβ2, PDGFBB (Platelet-derived growth factor BB — тромбоцитарный фактор роста) были повышены у данной группы детей по сравнению с детьми с самопроизвольным регрессом заболевания [12, 13] (табл. 1, 2).

 

Таблица 1. Среднее содержание цитокинов и факторов роста в плазме крови у детей с различным течением ретинопатии (пг/мл)

Table 1. Average content of cytokines and growth factors in plasma in children with different course of retinopathy (pg/ml)

Цитокин Cytokine	Дети с аваскулярными зонами, у которых РН не развилась Children with avascular zones who have not developed ROP	Дети с аваскулярными зонами с развившейся впоследствии РН Children with avascular zones with subsequently developed ROP	Дети с РН 1–2 стадии (с самопроизвольным регрессом впоследствии) Children with stage 1–2 ROP (with spontaneous regression later)	Дети с РН 1–2 стадии (с прогрессированием до «пороговых» стадий впоследствии) Children with stage 1–2 ROP (with progression to «threshold» stages later)
MCP-1	124,87±30,52**	251,2±67,73**	118,09±19,06	200,9±40,95
TGFβ1	40983,4±20273,1**	12667,27±3065,1**	11906,25±1405,1	25269,71±8357,2
TGFβ2	315,92±113,2	206,79±122,4	35,65±28,8*	163,32±39,6*
VEGF-A	195,2±77,2	134,4±23,8	88,5±10,9*	175,3±37,6*
PDGFBB	3230,4± 814,6	2467,1± 646,1	1395,4±243,3**	3417,3± 1131,4**

* различия достоверны по Манн-Уитни.

** различия на уровне тенденции по Стьюденту.

* differences are significant according to Mann-Whitney.

** differences at the level of the Student’s trend.

 

Таблица 2. Средние значения концентрации инсулиноподобных ростовых факторов в сыворотке крови детей трёх клинических групп на момент первого офтальмоскопического обследования

Table 2. Average values of the concentration of insulin-like growth factors in the blood serum of children of three clinical groups at the time of the first ophthalmoscopic examination

Показатель Indicaror	Дети без РН Children without ROP	Дети с РН II типа Children with ROP type II	Дети с РН тяжёлого течения Children with ROP of severe course
	Среднее значение, диапазон, пг/мл Average value, range, pg/ ml	Среднее значение, диапазон, пг/мл Average value, range, pg/ ml	Среднее значение, диапазон, пг/мл Average value, range, pg/ml
IGF-I	27,7 (12,03–38,91)	26,2 (13,95–47,94)	19,3 (7,74–33,44)
IGF-II	108,7 (81,9–122,08)	128,8 (79,47–223,66)	167,6 (79,52–271,74)

 

Таблица 3. Содержание катехоламинов в плазме крови крысят опытной и контрольной групп

Table 3.The content of catecholamines in the rats' blood plasma of the experimental and control groups

Возраст животных, сут. Age of animals, days	Уровень дофамина, пмоль/г Dopamine level, pmol/g		Уровень L-ДОФА, пмоль/г		Уровень норадреналина, пмоль/г
	Опыт experiment	Контроль Control	Опыт experiment	Контроль control	Опыт experiment	Контроль control
14	0,23±0,13	0,26±0,18	0,31±,04*	0,42±0,08	3,03±1,54	3,67±1,73
21	0,15±0,06	0,18±0,05	0,87±0,29*	1,53±0,61	3,39±1,92	3,64±1,22
30	0,09±0,02	0,09±0,03	0,33±0,198	0,21±0,08	2,83±0,58	3,42±1,72

* различия достоверны (р <0,05) по сравнению с контролем.

* differences are significant (p <0.05) compared to control.

 

Применение комплекса статистических методов обработки данных позволило нам обозначить «критические» значения концентрации указанных факторов с прогностической целью, а именно: содержание MCP1 >95 пг/мл, IGF-II >140 пг/мл, TGFβ1 <18000 пг/ мл и IGF-I <24 пг/мг в сыворотке крови у недоношенных детей на сроке до появления первых признаков заболевания. Кроме того, уровни VEGF-A >108 пг/мл, TGFβ2 >100 пг/ мл, PDGF-BB >1800 пг/мл при манифестации РН позволяют отнести их к группе высокого риска развития РН тяжёлого течения [12, 13].

В экспериментальной части работы были получены данные о патогенетической роли дофамина, L-ДОФА и норадреналина в развитии РН in situ и системно [14–17].

В данной статье представим более значимые в прогностическом плане результаты исследования их системного уровня в эксперименте и клинике. На 14-е сутки, т.е. на сроке индукции патологической васкуляризации при экспериментальной РН в разработанной нами модели заболевания [19], было выявлено достоверное снижение уровня L-ДОФА в плазме крови в опытной группе крысят по сравнению с контрольной группой [13]. Содержание норадреналина и дофамина не различалось между группами (табл. 3).

В клинике содержание моноаминов (дофамина, норадреналина и серотонина) было определено в 39 пробах крови (у 36 детей). Дети были разделены на две группы: дети без РН и дети с РН. В каждой группе исследование проводилось на сроках 32–35 недель и 36–39 недель постконцептуального возраста (ПКВ), что клинически соответствуют срокам манифестации и пика прогрессирования РН. Дофамин определялся в 44,4% проб, серотонин и норадреналин — в 100% проб. Достоверных различий по содержанию дофамина у детей разных групп выявлено не было. Уровень серотонина был достоверно снижен у детей с РН по сравнению с детьми без РН на сроке 32–35 недель ПКВ (рис. 1) [13].

Уровень норадреналина не различался между группами детей с РН и без РН, однако, выявлена тенденция к повышению его концентрации (p=0,06) в группе детей с РН на сроке 36–39 недель ПКВ, т.е. при прогрессировании заболевания (рис. 2) [13].

Статистическая обработка результатов позволила заключить, что низкое содержание серотонина (менее 17,0 пг/мл) в сыворотке крови недоношенных детей на сроке 32–35 недель ПКВ может служить ещё одним лабораторным критерием развития РН. У детей с начальными стадиями РН нарастание концентрации норадреналина при динамическом наблюдении может служить маркёром прогрессирования заболевания [13].

 

Рис. 1. Содержание серотонина (пг/мл) в плазме у детей с ретинопатией и без ретинопатии на сроке до 35 недель постконцептуального возраста.

Fig. 1. Plasma serotonin content (pg / ml) in children with and without retinopathy for up to 35 weeks of post-conceptual age.

 

Рис. 2. Содержание норадреналина (пг/мл) в плазме детей с ретинопатией.

Fig. 2. The content of norepinephrine (pg/ml) in the plasma of children with retinopathy.

 

В отношении АТ-II в эксперименте нами получены данные о том, что на сроке, соответствующем наличию аваскулярных зон сетчатки, его ретинальный уровень у крысят с ЭРН был статистически значимо выше, чем у крысят контрольной группы. Это наблюдение может свидетельствовать о проангиогенной роли данного участника ренин-ангиотензивной системы (РАС) в индукции патологической неоваскуляризации при ЭРН, а также о возможной прогностической роли на сроке до манифестации заболевания [18].

Обсуждение

В многочисленных исследованиях было показано, что ключевую роль в развитии РН играет дисбаланс регулирующих ретинальный ангиогенез факторов, развивающийся вследствие того, что процесс васкуляризации сетчатки при преждевременном рождении ребёнка «вынужден» завершаться во внеутробных агрессивных для себя условиях [12]. Построение новых алгоритмов скрининга РН во многом базируется на углублённом изучении патогенетического значения различных показателей системного иммунологического и биохимического статуса недоношенных детей и на оценке их уровня на доклинических сроках.

Проведённый нами анализ содержания цитокинов различного биологического действия в плазме крови недоношенных детей на разных сроках наблюдения подтвердил уже изученную роль VEGF-A и IGF-I в развитии РН, а также выявил ряд новых, ранее малоизвестных в аспекте патогенеза РН факторов. К числу таких факторов относятся ростовые факторы IGF-II, MCP1, PDGF-BB, TGF-β1 и TGF-β2. Следует более подробно остановиться на свойствах вновь выявленных потенциально перспективных лабораторных маркёров развития РН.

Роль IGF-II в регуляции ангиогенеза изучается сравнительно недавно. Имеются данные об участии данного ростового фактора в развитии и прогрессировании некоторых видов детской онкопатологии как одного из индукторов неоваскуляризации. В одной из недавних работ были показаны его проангиогенные свойства на модели кислород-индуцированной ретинопатии на мышатах. Было выявлено, что пептид, синтезированный на основе IGF-II, выступал в роли активного ингибитора ангиогенеза, что учёные объясняли частичным конкурентным связыванием с рецепторами инсулиноподобных ростовых факторов [20]. Полученные нами данные также свидетельствуют о его проангиогенных свойствах в патогенезе РН.

Роль цитокина МСР-1 в развитии различной вазопролиферативной офтальмопатологии изучается довольно активно. Было выявлено повышение уровня MCP-1 в стекловидном теле пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией [21]. В аспекте патогенеза РН было выявлено, что у недоношенных детей, у которых впоследствии развилось заболевание, отмечалось более высокое содержание МСР-1 в пуповинной крови по сравнению с недоношенными детьми без РН и доношенными младенцами [22]. Более того, среди недоношенных детей с массой тела при рождении менее 1000 г те, кто нуждался в кислородотерапии более 6 часов, имел более высокие показатели МСР-1 в крови, взятой на 3-й день терапии, по сравнению с теми, кто получал кислород в течение менее длительного периода [23]. Было показано, то МСР-1 участвует в привлечении макрофагов и клеток микроглии во время ишемической фазы течения РН [24, 25]. Механизм влияния MCP1 на ангиогенез связывают с его стимуляцией экспрессии HIF1α и VEGF-A [26]. В нашей работе также подтвердились его проангиогенные свойства.

PDGF-BB — ростовой фактор, относящийся к семейству тромбоцитарных факторов роста, является митогеном для глиальных клеток и клеток мезенхимального происхождения, включая перициты сосудов [27]. Повышение экспрессии PDGF-BB было выявлено при развитии пролиферативной ретинопатии, которая сопровождалась пролиферацией астроцитов, перицитов и эндотелиальных клеток [28]. Также повышение системного уровня PDGF-BB сопровождало развитие неоваскулярной формы ВМД [29]. Проангиогенные свойства PDGF-BB доказывает также тот факт, что его ингибирование способно увеличивать эффективность анти-VEGF терапии при различных моделях ретинальной неоваскуляризации [30]. Блокирование рецепторов PDGF-BB также приводит к подавлению опухолевого ангиогенеза [31, 32]. Полученные нами данные свидетельствуют об участии PDGF-BB в регуляции патологического ангиогенеза при РН в качестве его активатора.

Данные о роли TGF-β1 в ангиогенезе и патогенезе РН противоречивы. Снижение TGF-β1 было выявлено при экспериментальной РН у мышей на раннем сроке [33]. Сведения о возможном однонаправленном характере действия TGF-β1 вместе с VEGF-А [34] позволяют предположить, что недостаток TGF-β1 и VEGF-А в определённые сроки способны вызвать задержку роста сосудов и привести в дальнейшем к более тяжёлому течению РН. Наши данные, полученные в отношении роли TGF-β1 в патогенезе РН, могут свидетельствовать о его антиангиогенных свойствах. Наши результаты согласуются с данными исследования Sood и соавт., в котором более высокий уровень TGF-β1 выявлялся у детей без РН по сравнению с детьми с РН, причём минимальные значения определялись у детей с неблагоприятным течением РН [35]. Механизмы участия TGF-β1 в процессах нарушения ангиогенеза сетчатки при РН до конца не изучены.

TGF-β2 рассматривается рядом авторов в качестве фактора развития соединительнотканной пролиферации. Была выявлена стимулирующая роль TGF-β2 в развитии фиброзных изменений при ВМД в условиях гипоксии, а также было показано, что уровень TGF-β2 в стекловидном теле прямо пропорционально коррелировал с выраженностью пролиферативной витреоретинопатии [36]. Выявленные нами изменения уровня TGF-β2 говорят о его возможном участии в патогенезе РН в качестве профибровазопролиферативного фактора.

Необходимо тщательно проанализировать наши результаты, полученные в отношении моноаминов. Уровень серотонина был достоверно снижен у детей с РН по сравнению с детьми без РН на сроке 32–35 недель ПКВ, что говорит о его антиангиогенных свойствах и согласуется с данными литературы о способности серотонина подавлять синтез VEGF-А [37]. Кроме того, серотонин является предшественником мелатонина, который благодаря своим антиангиогенным и антиоксидантным свойствам способен ингибировать патологический ангиогенез при ЭРН [38]. Также у детей с РН была выявлена тенденция к повышению содержания норадреналина по мере прогрессирования заболевания, что говорит о его проангиогенных свойствах и требует дальнейшего изучения на большей выборке. В эксперименте получены крайне интересные данные в отношении предшественника дофамина L-ДОФА, свидетельствующие о его антиангиогенных свойствах при развитии патологии [14, 15, 19]. Более того, низкий системный уровень L-ДОФА может быть рассмотрен в качестве прогностического признака развития экстраретинальной вазопролиферации при ЭРН. Это обстоятельство является основой для планирования клинических исследований с целью определения прогностического значения уровня L-ДОФА в сыворотке крови недоношенных детей в качестве потенциального лабораторного критерия скрининга РН [19].

Из всех компонентов РАС наше внимание в аспекте патогенеза РН привлёк эффекторный пептид АТ-II, поскольку в ряде работ были обнаружены его проангиогенные свойства. Так, была показана его способность стимулировать пролиферацию эндотелиальных и гладкомышечных клеток, миграцию перицитов и гипертрофию гладкомышечных клеток [39]. В качестве основного возможного медиатора его ангиогенных свойств рассматривается VEGF-А [40]. Указанные свойства данного пептида нашли подтверждение и в нашей работе. Более того, полученные данные потенциально имеют большое практическое значение для применения в клинике в качестве прогностического фактора развития РН его концентрации в сыворотке крови и требуют дальнейшего изучения содержания данного биологически активного вещества на системном уровне в эксперименте и клинике.

Заключение

На основе результатов комплексной клинико-экспериментальной работы были определены лабораторные маркёры, позволяющие на доклинической стадии РН и на стадии её дебюта выделять группу детей с высоким риском неблагоприятного течения заболевания.

Исследование цитокинового статуса выявило, что такими маркёрами являются системный уровень MCP1 >95 пг/мл, IGF-II >140 пг/мл, TGFβ1 <18000 пг/мл, IGF-I <24 пг/мг, VEGF-A >108 пг/мл, TGFβ2 >100 пг/мл, PDGF-BB >1800 пг/мл. Считаем целесообразным проведение оценки содержания данных факторов в сыворотке крови недоношенных детей в указанные сроки с целью возможного корректирования тактики ведения данной группы детей на этапах выхаживания.

Среди моноаминов свою прогностическую роль обнаружили серотонин и L-ДОФА, при этом системное пороговое значение концентрации серотонина определено в клинике (менее 17,0 пг/мл) и может быть рекомендовано к применению в практической деятельности. В то же время L-ДОФА на данном этапе исследований проявил свои прогностические свойства только в эксперименте, что открывает широкие перспективы для продолжения клинических исследований.

АТ-II явился критерием развития РН лишь в экспериментальной части работы, что является основой для будущих клинических испытаний.

Намечены пути совершенствования системы скрининга РН, требующие продолжения работы для уточнения механизмов выявленных феноменов, расширения спектра лабораторных критериев развития РН и оценки возможности внедрения полученных результатов в клиническую практику.

About the authors

Lyudmila A. Katargina

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: katargina@igb.ru
ORCID iD: 0000-0002-4857-0374

Dr. Med. Sci., professor

Russian Federation, Moscow

Natal’ya B. Chesnokova

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: nchesnokova2012@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7856-8005

Dr. Biol. Sci., professor

Russian Federation, Moscow

Natal’ya V. Balatskaya

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: balnat07@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-8007-6643
SPIN-code: 4912-5709

Cand. Med. Sci.

Russian Federation, Moscow

Natal’ya Anatolievna Osipova

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: natashamma@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3151-6910
SPIN-code: 5872-6819

Cand. Med. Sci.

Russian Federation, Moscow

Anna Yurievna Panova

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Author for correspondence.
Email: annie_panova18@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2103-1570

junior researcher

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files