PROTEOMIC DIAGNOSTIC TECHNOLOGIES AND THEIR APPLICATION FOR THE REFRACTIVE CORRECTION OF AMETROPIA

Full Text

Введение. Организация медицинской помощи возрастной группе пациентов с аномалиями рефракции до сих пор остается мало изученной проблемой. Многообразие алгоритмов эксимерлазерной коррекции первичных аметропий у возрастных пациентов требует создания системы дифференцированных показаний к их проведению, особой подготовки и медикаментозного сопровождения. Несмотря на убедительные данные математического анализа о превалировании в ближайшие десятилетия возрастного населения в популяции, статистика по устранению аметропий среди лиц старше 45 лет с помощью рефракционных хирургических технологий отражает минимальный сегмент в структуре пациентов с нарушениями рефракции. Одним из сдерживающих факторов в принятии решения на проведение рефракционной операции является пресбиопия [1]. Хирургическая коррекция пресбиопии остается одним из самых сложных аспектов рефракционной хирургии. Для ее решения предложено несколько стратегий моделирования топографических профилей роговицы. Зарубежные исследования последних лет показывают, что биомеханический ответ тканей роговицы на формирование клапана в процессе операции и лазерную абляцию приводит к изменению формы роговицы не только в центре, но и на периферии, а также по задней поверхности, существуют основания к биоптическому подходу выбора коррекции пресбиопии [2]. Арсенал оптических, лазерных и хирургических методов коррекции пресбиопии расширяется с каждым годом. Выбор в пользу лазерных хирургических методов коррекции пресбиопии делается при астигматизме, плохо корригируемом очковыми стеклами, контактными линзами, и/или их непереносимости, в силу профессиональных или психологических особенностей пациента [3]. Данный аспект, по нашему мнению, зависит, прежде всего, уже от исходных изменений глазной поверхности пациента старше 35 лет. Многочисленные исследования подтверждают возрастание частоты изменений глазной поверхности в старших возрастных группах [4-6], а сама процедура хирургического вмешательства усугубляет эти изменения. В случае формирования сложного топографического профиля для получения мультифокальных свойств у пациентов с пресбиопией, качество глазной поверхности имеет особое значение, поскольку при нестабильной слезной пленке изменяются показатели оптической системы, что приводит к снижению зрительных функций. Анализ динамики максимально корригированной остроты зрения (МКОЗ) в послеоперационном периоде выявил ее снижение на две и более строки при всех модификациях пресбиопических рефракционных вмешательств у 6,5-28% пациентов на срок до шести месяцев. [1, 7-9]. Авторы приписывают потерянные строки в первую очередь усилению синдрома «сухого глаза». Во всех случаях потребовалось дополнительное медикаментозное лечение (инстилляции циклоспорина (Рестасис, Аллерган, США), а также обтюрация слезных точек. Таким образом, изучение особенностей антиоксидантной защиты глазной поверхности у пациентов с аметропией и пресбиопией перед и после рефракционного вмешательства является актуальным. Цель исследования: анализ протеомного статуса слезной жидкости и состояния глазной поверхности у пациентов с аметропиями до и после операции ЛАСИК. Материал и методы. В исследование включены 163 пациента, которым была проведена операция ЛАСИК на базе ГБОУ ВО «Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко» Минздрава России. У данных пациентов оценивалось состояние глазной поверхности, уровень экспрессии пероксиредоксина 6 до и после операции ЛАЗИК. В зависимости от вида клинической рефракции пациенты были распределены на 3 группы. Первую группу составил 51 (102 глаза) пациент зрелого возраста (от 35 до 54 лет) с миопией высокой степени и астигматизмом. Во вторую группу вошло 26 (52 глаза) пациентов зрелого возраста (от 35 до 55 лет) с гиперметропией средней, высокой степени и астигматизмом. Третья группа - группа сравнения - 86 (172 глаза) пациентов молодого возраста (от 18 до 34 лет) с миопией высокой степени и астигматизмом. Офтальмологическое обследование проводили по общепринятым методикам. Для определения вида клинической рефракции, степени астигматизма использовали автоматический рефрактометр HUMPHREY, для определения толщины роговицы (пахиметрия), а также длины передне-заднего отрезка глаза - ультразвуковую установку OcuscanRxP (Alcon, США), для кератотопографии - KeratronScout OPTIKON, Италия. Операции производились на эксимер-лазерной системе ESIRIS (SCHWIND, Германия). Для анестезии использовали проксиметакаин 0,5%. Для формирования лоскута применяли микрокератом Carriazo-Pendular (SCHWIND, Германия). Осуществляли диагностику «сухого глаза» и состояния роговицы (тест Липкоф, тест Ширмера, проба Норна, окраска роговицы флюоресцеином), определяли показатели антиоксидантной активности слезы - экспрессия пероксиредоксина 6 (PRDX6), наличие или отсутствие гамма-глобулина (протеомные технологии). Для иммуноферментного анализа использовали Western-блот. Мажорные белки слезы анализировали методом MALDI-TOF - триптического гидролиза белка в полиакриламидном геле, надгелевый раствор использовали для получения MALDI-масс-спектров. Подготовку образцов для масс-спектрометрии проводили смешиванием на мишени раствора образца и раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты, масс-спектры получали на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона. Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск проводили в базе данных NCBI среди белков всех организмов с указанной точностью с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов акриламидом. Статистическая обработка полученных данных была проведена с использованием прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoft) и BIOSTST. Количественные данные при нормальном распределении признака представлены в виде M ± σ, где M - выборочное среднее, σ - стандартное отклонение. В случаях, когда распределение отличалось от нормального, данные были представлены как Ме (медиана), размах показателей (min, max) и интерквартильных размах 25% и 75% процентилей (25%; 75%). Сравнение количественных показателей двух связанных выборок при соблюдении условии нормальности распределения проведено с использованием парного t-критерия Стьюдента, двух не связанных между собой выборок - t-критерия Стьюдента. Если распределение не являлось нормальным, для анализа связанных выборок использовали критерий Уилкоксона, не связанных выборок - U-критерий Манна-Уитни. Для сравнения нескольких независимых групп при нормальном распределении использовали дисперсионный анализ, в случаях, когда распределение не было нормальным - критерий Краскела-Уоллиса. Исследование выборки на предмет нормальности распределения проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Для установления наличия связи между изучаемыми признаками применяли коэффициент корреляции Пирсона и ранговой корреляции Спиремена. Силу функциональной связи между признаками оценивали по шкале Чертока: при коэффициенте корреляции менее 0,1 считали, что связь отсутствует, при r = 0,1-0,3 - слабая связь, 0,3-0,5 - умеренная связь, 0,5-0,7 - связь средней силы, 0,7-0,9 - сильная связь, более 0,9 - очень сильная связь. При проверке статистических гипотез уровень значимости принимался равным 0,05. Статистически значимыми считались различия при p < 0,05, высоко достоверными при p < 0,01. Результаты. Оценка состояния глазной поверхности до операции ЛАСИК представлена в табл. 1. Нами проводилась сравнительная оценка состояния глазной поверхности у пациентов возрастных групп (1-я группа - миопия высокой степени, астигматизм; 2-я группа - гиперметропия высокой, средней степени, астигматизм) и более молодого возраста (3-я группа - миопия высокой степени, астигматизм) до операции ЛАСИК. Пациентам выполнялся тест Липкоф, тест Ширмера, проба Норна и окрашивание роговицы флюоресцеином. Во всех группах достоверным был тест Липкоф. В 1-й группе он составлял 1,82 ± 0,60 мм (стадия 3), что соответствовало 3 складкам конъюнктивы, тогда как во 2-й и 3-й группах (1,39 ± 0,21 мм и 1,37 ± 0,26 мм) он соответствовал 2 складкам конъюнктивы. Таким образом, тест Липкоф был наиболее выражен у пациентов с миопией более старшего возраста. Снижение пробы Норна отмечалось у всех пациентов зрелого возраста (1-я и 2-я группы) и показатели достоверных отличий между ними не было (8,0 ± 1,46 сек и 8,23 ± 0,87 сек). В 3-й группе (молодые пациенты с миопией) проба Норна была в 1,3 раза выше, чем в 1-й и во 2-й группах (10,99 ± 1,40 сек). Тест Ширмера у пациентов 2-й и 3-й групп (зрелый возраст) был несколько снижен (12,59 ± 0,88 мм и 11,88 ± 1,27 мм), что соответствовало I степени синдрома «сухого глаза». Значение этого показателя у молодых пациентов (3 группы) было в 1,4 раза выше, чем у зрелых, и соответствовало норме. Признаки повреждения роговицы были выражены незначительно у пациентов зрелого возраста и окраска роговицы флюоресцеином составила 2,12 ± 0,47 баллов (средняя интенсивность) у пациентов 1-й группы и 1,53 ± 0,39 (слабой интенсивности) 2-й. Причем у пациентов с гиперметропией и астигматизмом (2-я группа) этот показатель в 1,4 раз ниже, чем у пациентов с миопией и астигматизмом (1-я группа). У пациентов молодого возраста окраска роговицы была более выражена - 3,02 ± 0,42 (средней интенсивности), что в 1,4 раза больше, чем у пациентов 1-й группы и в 1,9 раз - чем во 2-й. В табл. 2 приведена оценка показателей рефракции, толщины роговицы до операции ЛАСИК. Оценка толщины роговицы (мкм) проводилась с помощью пахиметрии на А-скане (Alcon). Вид клинической рефракции, степень ее изменения (миопия, гиперметропия), а также степень астигматизма оценивали с помощью рефрактометрии. Толщина роговицы существенно не отличалась у пациентов первых двух групп: в 1-й группе была не более 552,3 ± 30,75 μm, что на 9 μm меньше, чем во 2-й - 561,6 ± 40,3 μm. В 3-й группе - на 24 μm меньше, чем во 2-й и на 15 μm меньше, чем в 1-й. Оценка показателей антиоксидантной и иммунной активности слезы у пациентов до операции ЛАСИК см. в табл. 3. Нами был исследован уровень антиоксидантной защиты у пациентов в данных группах. Наибольший уровень экспрессии PRDX6 был выявлен у молодых пациентов с миопией и астигматизмом (3-я группа) - 17,77 ± 1,03. У пациентов зрелого возраста с миопией и астигматизмом (1-я группа) этот показатель был в 1,3 раза ниже (13,57 ± 0,83). Отличалась 2-я группа (пациенты зрелого возраста с гиперметропией и астигматизмом). Уровень экспрессии PRDX6 в ней был в 6,1 раз ниже, чем у молодых пациентов и в 1,3 раза ниже, чем у возрастных пациентов с миопией. Можно сделать вывод, что у миопов уровень антиоксидантной защиты отличается от гиперметропов, а также он изменяется в зависимости от возраста. У пациентов всех групп отсутствовал гамма-глобулин. Состояние глазной поверхности после операции ЛАСИК Нами проводилась сравнительная оценка состояния глазной поверхности у возрастных пациентов 1-й группы (миопия высокой степени, астигматизм), 2-й (гиперметропия высокой, средней степени, астигматизм), а также молодых пациентов 3-й группы (миопия высокой степени, астигматизм) после операции ЛАСИК. Пациентам двух групп выполнялся тест Липкоф по описанной ранее методике. Не имела существенного практического значения после ЛАСИК оценка общего объема слезопродукции: тест Ширмера использовался нами ограниченно из-за реакции пациентов на тест-полоски после проведения эксимерлазерного вмешательства. Основным исследованием мы считаем также как и до операции - это проведение пробы Норна (определение времени разрыва слезной пленки). Для этого использовали 1% раствор флюоресцеина в виде полосок офтальмологических диагностических Bio Glo, после чего пациент моргал без сильного сжатия век для распространения флюоресцеина. Далее просили пациента смотреть прямо перед собой, не моргая. Осматривали глаза на щелевой лампе (Racher 255) до появления темных пятен на окрашенной слезной пленке, отмечая при этом время, за которое эти пятна появлялись. Результат оценивали по Lemp, 1995 г., и Abelson, 2002 г. Так же окрашивали роговицы флюоресцеином. В область бульбарной конъюнктивы с помощью диагностических полосок инстиллировали флюоресцеин, после чего пациент моргал без сильного сжатия век для распространения красителя. Далее просили пациента смотреть прямо перед собой. Осматривали глаза на щелевой лампе (Racher 255) до появления окрашенных участков роговицы. Затем определяли интенсивность окраски роговицы по стадиям, описанным ранее. Общая оценка результатов тестирования количества, качества и стабильности слезы, а также состояния роговицы приведена в табл. 4. У пациентов 1-й группы отмечалось снижение пробы Норна до 5,80 ± 1,54 сек, что в 1,1 раз ниже, чем у пациентов 2-й и 3-й групп. Интенсивность окраски флюоресцеином роговицы оценивалась в 3,11 ± 0,44 балла, что в 1,6 раз выше, чем у пациентов 2-й группы и в 1,2 раза ниже, чем в 3-й группе. Тест Липкоф и тест Ширмера были мало показательными. Таким образом, степень выраженности «сухого глаза» после ЛАСИК была выше у возрастных пациентов с миопией 1-й группы. Оценка показателей рефракции, толщины роговицы после операции ЛАСИК и представлена в табл. 5. После ЛАЗИК наименьшая толщина роговицы отмечалась у молодых и возрастных пациентов с миопией. Во 2-й группе у пациентов с гиперметропией толщина роговицы была в 1,1 раз выше, чем в 1-й и 3-й группах у пациентов с миопией. Оценку показателей антиоксидантной и иммунной активности слезы после операции ЛАСИК см. в табл. 6. Для исследования уровня антиоксидантной защиты у пациентов в данных группах нами проводился забор слезной жидкости для исследования белкового состава слезы. Проводили PAAG электрофорез, среднюю концентрацию белка в пробах определяли спектрофотометрически с использованием спектрофотометра Nano-Drop 1000, для дальнейшего иммуноферментного анализа использовали Western-блот. Мажорные белки слезы анализировали методом MALDI-TOF - триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле, надгелевый раствор использовали для получения MALDI-масс-спектров. Подготовку образцов для масс-спектрометрии проводили смешиванием на мишени раствора образца и раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты, масс-спектры получали на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона. Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск проводили в базе данных NCBI среди белков всех организмов с указанной точностью с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов акриламидом. В 1-й группе (миопия высокой степени) у возрастных пациентов отмечалось высокое содержание PRDX6 в слезе 19,31 ± 0,71, свидетельствующее о достаточном уровне антиоксидантной защиты. Во 2-й группе (гиперметропия высокой, средней степени) содержание PRDX6 возросло слабо и составило 3,09 ± 0,47. В 3-й группе у молодых пациентов с миопией высокой степени уровень экспрессии PRDX6 - 19,87 ± 1,05 несколько увеличился. Обсуждение. Анализ литературных источников и собственных клинических данных пациентов подтверждает, что адаптация к изменению рефракции с возрастом в большинстве случаев является серьезным испытанием для пациента. Пресбиопия клинически проявляется чаще всего в возрасте между 40 и 45 годами и поражает примерно 31% индивидов этой возрастной группы [10-12]. После 52 лет пресбиопия отмечается практически в 100% случаев. Существует много потенциальных факторов риска, способствующих более раннему развитию пресбиопии [10, 13, 14]. Наиболее важными факторами являются аномалии рефракции: манифестация пресбиопии у лиц с гиперметропией происходит несколькими годами раньше, чем у людей с миопией или эмметропией. Но нельзя забывать, что кроме рефракционных изменений происходят срывы метаболических и функциональных резервов у лиц в данной возрастной группе. Так, на возрастное снижение аккомодационных способностей влияют как биомеханические, так и биохимические, физиологические факторы, взаимодействие которых приводит к клиническому проявлению пресбиопии [15-19]. Происходящие с возрастом биохимические изменения вызывают увеличение количества дисульфидных мостиков в молекулах коллагена капсулы и ядра хрусталика, приводя к стабилизации этих молекул благодаря процессу сопряженного пересечения (cross-linking) [20]. Большинство исследователей рассматривают детально процесс изменения аккомодационных механизмов, в то время когда основные ткани глаза, особенно роговица, испытывают воздействие окислительного стресса, который изменяет биомеханические свойства оболочек [14, 21, 22]. В этой связи изучение механизмов антиоксидантной защиты у возрастных пациентов с миопией показало, что уровень экспрессии пероксиредоксина 6 после ЛАСИК повысился в 1,4 раза, у пациентов с гиперметропией - в 1,07 раз, то есть изменился незначительно после операции и был 6,2 раза меньше, чем у миопов. Выводы 1. У возрастных пациентов с пресбиопией и аметропией до операции ЛАСИК отмечаются признаки синдрома «сухого глаза». У пациентов 1-й группы достоверными были сразу 2 пробы на качество слезы: тест Липкоф (1,82 ± 0,2 мм - стадия 3) - соответствовал 3 складкам конъюнктивы, проба Норна (8,0 ± 1,46 сек) свидетельствовала о наличии синдрома «сухого глаза» II степени; у пациентов во 2-й группе - тест Липкоф 1,31 ± 0,2 мм (стадия 2), проба Норна 8,23 ± 0,87 сек (снижение) - синдром «сухого глаза» II степени. Также отмечалось нерезкое снижение показателя теста Ширмера (12,59 ± 0,88 и 11,88 ± 1,27), подтверждающее наличие синдрома «сухого глаза». 2. Уровень антиоксидантной защиты (экспрессии пероксиредоксина 6) глазной поверхности зависит от вида аметропии: у возрастных пациентов с миопией уровень экспрессии PRDX6 до операции ЛАСИК был в 4,7 раз выше (13,57 ± 0,83), после операции - в 6,2 раза выше (19,31 ± 0,71), чем у пациентов с гиперметропией (2,88 ± 0,38 и 3,09 ± 0,47 соответственно). 3. Уровень антиоксидантной защиты (экспрессии пероксиредоксина 6) глазной поверхности до операции ЛАСИК зависит от возраста пациента: у возрастных пациентов с миопией уровень экспрессии PRDX6 был в 1,3 раза меньше, чем у молодых (13,57 ± 0,83 и 17,77 ± 1,03). 4. После операции ЛАСИК изменяется значимость тестов на продукцию и качество слезы. Достоверной во всех группах является проба Норна, свидетельствовавшая о наличии синдрома «сухого глаза» II степени.

About the authors

M. A Kovalevskaya

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko

394000, Voronezh, Russian Federation

I. V Chernikova

Dr. Chernikova Eye Centre

394000, Voronezh, Russian Federation

V. S Podoprigora

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko

394000, Voronezh, Russian Federation

Mariya I. Sergeeva

Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko

Email: misoph@yandex.ru
assistant, Department of Ophthalmology, N.N. Burdenko Voronezh State Medical University, 394000, Voronezh, Russian Federation 394000, Voronezh, Russian Federation

References

Supplementary files