Evaluation of activity and severity of uveitis in children based on comprehensive biochemistry analysis

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Эндогенные увеиты являются актуальной медико-социальной проблемой детской офтальмологии, что обусловлено склонностью к генерализации, хроническому персистирующему течению и быстрому развитию широкого круга осложнений [1–7].

Распространённость увеитов у детей составляет 28–106 на 100 000 детского населения, что составляет в Российской Федерации в среднем 21 000 детей [8–11].

В настоящее время критерии оценки активности воспаления во многом субъективны, а применение объективных инструментальных методов диагностики нередко ограничено, в частности, в связи развитием осложнений, препятствующим визуализации заднего отрезка глаза, что затрудняет диагностику и выбор лечебной тактики.

Несмотря на применение современной комплексной терапии, слепота вследствие увеитов и их осложнений наблюдается у 2–15% пациентов [2, 5, 10]. Таким образом, необходим дальнейший поиск путей решения проблемы диагностики и лечения увеитов.

Установлено, что в патогенезе воспалительного процесса важную роль играет система протеолиза [12–16], однако, роль протеолитических ферментов и их ингибиторов при увеитах практически не изучена [17–23].

Цель. Изучение роли протеолитических ферментов и их ингибиторов в течении эндогенных увеитов у детей, разработка новых диагностических критериев.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В период с 2021 по 2022 гг. нами проведено обследование и лечение 76 пациентов с увеитом (41 девочка, 35 мальчиков, 135 глаз с увеитом) в возрасте от 3 до 17 лет (в среднем 10,4 ± 3,4 лет).

Оценка локализации, течения и активности увеитов проводились в соответствии с критериями, разработанными международной группой по изучению увеитов [24]. Передний увеит диагностирован у 29 пациентов, периферический — у 31, панувеит — у 16. У 59 пациентов воспалительный процесс был двусторонним, у 17 — односторонним. Увеит был ассоциирован с ювенильным идиопатическим артритом у 17 детей, с HLA-B27 — у трёх, герпесвирусная этиология определена у трёх, увеит был ассоциирован с болезнью Фогта-Коянаги-Харада у одного ребенка, у 52 детей носил идиопатический характер.

На момент включения в исследование все пациенты получали местную противовоспалительную терапию, 35 пациентов (46%) — системное иммуносупрессивное лечение. В ходе работы проведён анализ 56 операций, в том числе по поводу осложнённой катаракты — 28, глаукомы — 22, фиброза стекловидного тела — 6.

Пациентам проводили стандартное офтальмологическое обследование (визометрия, рефрактометрия, биомикроскопия, офтальмоскопия, тонометрия), по показаниям — оптическую когерентную томографию (ОКТ) заднего отрезка глаза (Nidek RS-3000, Heidelberg Engineering Spectralis OCT).

У всех пациентов проводили биохимическое исследование слёзной жидкости, сыворотки крови, а при проведении оперативного лечения — влаги передней камеры. В динамике было обследовано 64 ребёнка (84,2%) через 1, 3, 6 и 12 месяцев. Исследовано 1143 пробы слёзной жидкости, 283 пробы сыворотки крови, 79 проб влаги передней камеры (табл. 1).

 

Таблица 1. Количество исследованных проб в биологических жидкостях детей с увеитами

Table 1. Number of tested biological samples in children with uveitis

Фермент/ингибитор Enzyme/inhibitor	Слёзная жидкость Tear fluid	Влага передней камеры Anterior chamber aqueous humor	Сыворотка крови Blood serum
Альфа-2-макроглобулин Alpha-2-macroglobulin	336	39	154
Матриксная металлопротеиназа-9 Matrix metalloproteinase-9	312	20	48
Тканевый ингибитор металлопротеиназ – 1 Tissue inhibitor of metalloproteinases 1	192	7	25
Урокиназный активатор плазминогена Urokinase-type plasminogen activator	206	10	22
Плазминоген Plasminogen	97	7	34
Всего Total	1143	79	283

 

Группу сравнения составили: 10 детей по исследованию слёзной жидкости, 9 детей — по сыворотке крови, 5 детей — по влаге передней камеры. Критериями включения в группу по исследованию слёзной жидкости и сыворотки крови явились соматически здоровые дети старше 3 лет без патологии глаз или со слабой степенью миопии. В группу сравнения влаги передней камеры входили соматически здоровые дети старше 3 лет с врождённой катарактой.

Слёзную жидкость забирали из обоих глаз с помощью полосок стерильной фильтровальной бумаги шириной 5 мм, которые закладывали за нижнее веко на 5 минут. Минимум за 8 часов до взятия слезы пациентам были отменены инстилляции медикаментов. Для определения активности и содержания ферментов в сыворотке крови использовали кровь, взятую для биохимического анализа, входящего в стандарт обследования. Забор влаги передней камеры (0,1 мл) производили в условиях операционной под наркозом перед началом операции с помощью шприца 2,0 мл и иглы 31G.

Исследовали активность α2-МГ, содержание ММП-9, ТИМП-1, УПА и ПГ. Определение активности α2-МГ осуществляли ферментативным методом. Метод основан на том, что комплекс α2-МГ с трипсином сохраняет протеолитическую активность по отношению к низкомолекулярным субстратам, и на эту активность не влияет ингибитор трипсина из бобов сои. В качестве такого субстрата был использован N-бензоил-DL-аргинин-p-нитроанилид (БАПНА). Определение оптической плотности образцов проводили на многофункциональном фотометре для микропланшет Synergy MX (BioTek, США). Активность рассчитывали с помощью калибровочной кривой, отражающей зависимость оптической плотности от концентрации окрашенного продукта реакции p-нитроанилина и выражали в нмоль/мин·мл.

Концентрацию ММП-9, ТИМП-1, УПА и ПГ определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью наборов «ELISA kit for MMP-9»/tissue inhibitor of metalloproteinase 1»/plasminogen activator, urokinase (UPA)/Plasminogen» (Cloud-Clone Corp, США). ММП-9, ТИМП-1, ПГ выражали в нг/мл, УПА — в пг/мл. Определение оптической плотности образцов при 450 нм проводили на многофункциональном фотометре для микропланшет Synergy MX (BioTek, США).

Статистическая обработка результатов работы выполнена с использованием программы Stat Soft Inc. STATISTICA (версия 7), Analysis ToolPak MS Excel. Нормальность распределения оценивали при помощи критериев Шапиро-Уилка, Колмогорова-Смирнова. При нормальном распределении показателей результаты представлены в виде среднего арифметического (M) ± стандартного квадратического отклонения (σ), при ненормальном распределении показателей — в виде медианы (Me) (первого квартиля (Q1); третьего квартиля (Q3). Парное межгрупповое сравнение при нормальном распределении показателей производили по t-тесту Стьюдента, при ненормальном распределении с использованием U-критерия Манна-Уитни. При сравнении более двух выборок при нормальном распределении показателей использовали дисперсионный анализ «ANOVA», при ненормальном распределении — дисперсионный анализ Крускала-Уоллиса. За критический уровень значимости принято значение p <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ результатов показал, что активность и содержание протеолитических ферментов и их ингибиторов в сыворотке крови у детей с увеитом широко варьировали и не были связаны с активностью воспаления, поэтому дальнейший анализ представлен только для слёзной жидкости и влаги передней камеры (табл. 2).

 

Таблица 2. Активность и содержание протеолитических ферментов и их ингибиторов в слёзной жидкости и влаге передней камеры при разной активности увеита

Table 2. Concentrations of proteolytic enzymes and their inhibitors in tear fluid and anterior chamber aqueous humor by uveitis activity

Фермент/ингибитор Enzyme/inhibitor	Жидкость Sample	Группа сравнения Comparison group	Неактивный/ремиссия Inactive/remission	Субактивный/вялотекущий Subactive/indolent	Активный/обострение Active/recurrence
Активность α2-МГ, нмоль/мин·мл α2-MG (nmol/min/ml)	Слёзная жидкость Tear fluid	4,64	4,35	4,64	4,35
		(3,63; 6,09)	(2,61; 6,96)	(2,9; 7,18)	(3,19; 5,58)
	Влага передней камеры Anterior chamber aqueous humor	0,58	0,31	0,38	-
		(0,29; 0,58)	(0,22; 0,89)	(0,25; 1,16)
Содержание ММП-9, нг/мл MMP-9 (ng/ml)	Слёзная жидкость Tear fluid	2,97	1,1*	1,25	1,1**
		(1,46; 3,59)	(0,37; 2,24)	(0,59; 2,57)	(0,27; 2,48)
	Влага передней камеры Anterior chamber aqueous humor	0,01+	0,39	0,29	-
		(0,004; 0,08)	(0,31; 0,67)	(0,17; 0,56)
Содержание ТИМП-1, нг/мл TIMP-1 (ng/ml)	Слёзная жидкость Tear fluid	9,87	7,61	8,83†	8,28
		(3,1; 10,73)	(5,09; 10,51)	(6,88; 10,63)	(4,28; 11,85)
	Влага передней камеры Anterior chamber aqueous humor	0,28	13,55	10,16	-
			(8,08; 17,25)	(9,92; 11,85)
Содержание УПА, пг/мл uPA (pg/ml)	Слёзная жидкость Tear fluid	206,5††	46,5	66	80,64†††
		(111,94; 409,65)	(26,13; 100,3)	(29,83; 159,3)	(44,2; 187,8)
	Влага передней камеры Anterior chamber aqueous humor	3,1	-	15,9	-
				(10,4; 22)
Содержание ПГ, нг/мл PG (ng/ml)	Слёзная жидкость Tear fluid	6,2 (4,61; 7,95)	2,99 (1,11; 7,24)	4,25 (1,83; 10,21)	2,12 (1,04; 3,48)
	Влага передней камеры Anterior chamber aqueous humor	-	38,63	39,16 (34,92; 43,4)	-

* тенденция к снижению относительно группы сравнения (p=0,07);

* а trend towards a decrease compared to the comparison group (p=0.07);

** тенденция к снижению относительно группы сравнения (p=0,06);

** а trend towards a decrease compared to the comparison group (p=0.06).

Примечание:

+ — достоверно снижено относительно глаз с увеитом (p=0,006);

† — тенденция к росту относительно неактивного воспалительного процесса (p=0,08);

†† — достоверно повышено относительно глаз с увеитом (p=0,01);

††† — достоверно повышено относительно неактивного воспалительного процесса (p=0,04), анализ проведён в возрастной подгруппе старше 6 лет в связи возрастными особенностями содержания УПА в слёзной жидкости;

α2-МГ — альфа-2-макроглобулин;

MMP-9 — матриксная металлопротеиназа-9;

ТИМП-1— тканевый ингибитор металлопротеиназ-1;

УПА — урокиназный активатор плазминогена;

ПГ — плазминоген.

Notes:

+ A significant decrease compared to the eyes with uveitis (p=0.006).

† A trend towards an increase compared to inactive inflammation (p=0.08).

†† A significant increase compared to the eyes with uveitis (p=0.01).

††† A significant increase compared to inactive inflammation (p=0.04); the test was performed in children aged over 6 years due to age-related factors of tear uPA levels.

a2-MG — аlpha-2-macroglobulin.

MMP-9 — matrix metalloproteinase-9.

TIMP-1 — tissue inhibitor of metalloproteinases 1.

uPA — urokinase-type plasminogen activator.

PG — plasminogen.

 

Установлено, что с увеличением активности воспаления нарастает содержание УПА в слёзной жидкости (p = 0,04), что свидетельствует об активации протеолиза при активном воспалении (табл. 2, рис. 1). При активном увеите содержание УПА превышает 80,7 пг/мл, при вялотекущем/субактивном воспалении колеблется в диапазоне 46,6–80,6 пг/мл, при неактивном/ремиссии — менее или равно 46,5 пг/мл. Полученные данные позволяют использовать определение УПА в слёзной жидкости как один из критериев активности увеита [25].

 

Рис. 1. Содержание урокиназного активатора плазминогена в слёзной жидкости при различной активности увеита

Fig. 1. Concentrations of urokinase-type plasminogen activator in tear fluid by uveitis activity

 

Кроме того, обнаружено кратное увеличение содержания УПА во влаге передней камеры пациентов с увеитами по сравнению с группой сравнения (табл. 2, рис. 2), что также свидетельствует о роли УПА в патогенезе воспалительного процесса.

 

Рис. 2. Содержание урокиназного активатора плазминогена (УПА) и тканевого ингибитора металлопротеиназ-1 (ТИМП-1) во влаге передней камеры пациентов с увеитом и в группе сравнения

Fig. 2. Concentrations of urokinase-type plasminogen activator (UPA) and tissue inhibitor of metalloproteinases 1 (TIMP-1) in anterior chamber aqueous humor in uveitis and comparison groups

 

Содержание ММП-9 во влаге передней камеры детей с увеитом было значительно выше, чем в группе сравнения (р = 0,006), что также свидетельствует об активации протеолиза и участии данной молекулы в патогенезе воспаления (табл. 2, рис. 3).

 

Рис. 3. Содержание матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9) во влаге передней камеры пациентов с увеитами и в группе сравнения

Fig. 3. Concentrations of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in anterior chamber aqueous humor in uveitis and comparison groups

 

Одновременно обнаружено кратное увеличение содержания ТИМП-1 во влаге передней камеры при увеитах по сравнению с группой сравнения (табл. 1, рис. 2). В ходе исследования была выявлена также тенденция к увеличению содержания ТИМП-1 в слёзной жидкости (p = 0,08) при субактивных/вялотекущих увеитах в сравнении с неактивными (табл. 2). Полученные данные свидетельствуют об одновременной активации протеолитических ферментов и их ингибиторов при увеитах и возможной роли дисбаланса этих факторов в течении увеита.

Анализ активности и содержания протеолитических ферментов и их ингибиторов в зависимости от различной первичной локализации воспалительного процесса показал, что при панувеитах наблюдается более высокая активность α2-МГ в слёзной жидкости в сравнении с передними (p = 0,03) и периферическими (p = 0,1), более высокое содержание ММП-9 в слёзной жидкости в сравнении с передним (p = 0,1) и периферическим (p = 0,003) и тенденция к росту содержания ПГ в слёзной жидкости в сравнении с передним (p = 0,06) и периферическим (p = 0,12) (табл. 3).

 

Таблица 3. Активность и содержание протеолитических ферментов и их ингибиторов у детей с увеитом при различной первичной локализации воспалительного процесса

Table 3. Activity and content of proteolytic enzymes and their inhibitors in children with uveitis with different primary localization of the inflammatory process

Фермент/ингибитор Enzyme/inhibitor	Жидкость Sample	Активность и содержание протеолитических ферментов и их ингибиторов Concentrations of proteolytic enzymes and their inhibitors
		Передний увеит Anterior uveitis	Периферический увеит Peripheral uveitis	Панувеит Panuveitis
Активность А2-МГ, нмоль/мин·мл α2-MG (nmol/min/ml)	Слёзная жидкость Tear fluid	4,06 (2,61; 6,09)	4,5 (2,83; 6,96)	5,22 (3,48; 7,54)**
	Сыворотка крови Blood serum	124±24,98	114,06±25,56	119,15±23,11
	Влага передней камеры Anterior chamber aqueous humor	0,73 (0,23; 1,28)	0,35 (0,23; 0,61)	0,46 (0,28; 1,02)
Содержание ММП-9, нг/мл MMP-9 (ng/ml)	Слёзная жидкость Tear fluid	1,13 (0,51; 2,43)	0,97 (0,29; 2,22)	1,44 (0,89; 2,96)*
	Сыворотка крови Blood serum	45 (29,9; 60,4)	43,35 (33,68; 64,93)	77,8 (39,2; 106,2)
	Влага передней камеры Anterior chamber aqueous humor	0,26 (0,15; 0,33)	0,39 (0,27; 0,73)	0,74 (0,74; 0,74)
Содержание ТИМП-1, нг/мл TIMP-1 (ng/ml)	Слёзная жидкость Tear fluid	8,42 (6,5; 10,39)	8,41 (5,24; 11,04)	8,83 (6,2; 12,21)
	Сыворотка крови Blood serum	17,17 (11,61; 17,85)	15,78 (12,46; 17,12)	15,38 (13,8; 16,9)
	Влага передней камеры Anterior chamber aqueous humor	14,51 (12,42; 16,59)	11,61 (7,58; 14,35)	10,16 (10,16; 10,16)
Содержание УПА, пг/мл uPA (pg/ml)	Слёзная жидкость Tear fluid	57,32 (18,85; 148,45)	54,94 (28,12; 121,83)	66,62 (35,75; 135,4)
	Сыворотка крови Blood serum	332,71 (260,2; 390,57)	226,26 (164,44; 266,39)	214,65 (197,77; 320,7)
	Влага передней камеры Anterior chamber aqueous humor	15,9 (9,89; 29,29)	10,4 (8,47; 40,7)	20,78 (17,35; 27,13)
Содержание ПГ, нг/мл PG (ng/ml)	Слёзная жидкость Tear fluid	2,96 (1,04; 7,43)	3,05 (1,54; 6,72)	6 (2,15; 13,65)***
	Сыворотка крови Blood serum	112,15 (88,85; 128,19)	138,38 (121,08; 143,86)	120,95 (111,65; 129,73)
	Влага передней камеры Anterior chamber aqueous humor	43,14 (40,88; 45,39)	-	30,68 (30,68; 30,68)

* достоверное увеличение показателей относительно значений при периферическом увеите (p=0,003) и тенденция к росту относительно показателей при переднем увеите (p=0,1);

** достоверное увеличение показателей в сравнении с передним увеитом (p=0,03) и тенденция к росту в сравнении с периферическим увеитом (p=0,1);

*** тенденция к росту в сравнении с передним (p=0,06) и периферическим (p=0,12) увеитами.

* A significant increase compared to peripheral uveitis (p=0.003) and a trend towards an increase compared to anterior uveitis (p=0.1).

** A significant increase compared to anterior uveitis (p=0.03) and a trend towards an increase compared to peripheral uveitis (p=0.1).

*** A trend towards an increase compared to anterior (p=0.06) and peripheral uveitis (p=0.12).

Примечание:

α2-МГ — альфа-2-макроглобулин;

MMP-9 — матриксная металлопротеиназа-9;

ТИМП-1— тканевый ингибитор металлопротеиназ-1;

УПА — урокиназный активатор плазминогена;

ПГ — плазминоген.

Notes:

a2-MG — аlpha-2-macroglobulin.

MMP-9 — matrix metalloproteinase-9.

TIMP-1 — tissue inhibitor of metalloproteinases 1.

uPA — urokinase-type plasminogen activator.

PG — plasminogen.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время патогенетические аспекты увеитов у детей остаются недостаточно изученными, а диагностика активности и распространенности воспаления часто затруднена в силу малого возраста пациентов, субъективности используемых критериев и невозможности визуализации заднего отрезка глаза из-за состояния оптических сред. В настоящее время для оценки воспаления в переднем и заднем отрезках глаза применяется ряд методов, однако, для проведения каждого из них имеются ограничения, что свидетельствует о необходимости поиска более универсальных методов.

Известно, что в патогенезе воспалительного процесса на всех фазах наряду с иммунологическими факторами важную роль играет система протеолиза. Воспаление сопровождается активацией протеолиза, а также поступлением из сосудистого русла в очаг воспаления ингибиторов протеолитических ферментов и усилением местного синтеза антипротеаз [12–16]. Данные литературы о состоянии системы протеолиза при эндогенных увеитах малочисленны и являются преимущественно экспериментальными, а при увеитах детского возраста таких данных нет. Отмечено увеличение содержания ММП-9 во влаге передней камеры при активном увеите в эксперименте и клинике [17–20], а Y. El-Shabrawi с соавт. обнаружили корреляцию уровней ММП-9 и ММП-2 во влаге передней камеры с содержанием провоспалительных цитокинов Il-1β, Il-12, IL-1ra [19]. Показана корреляция активности α2-МГ в слёзной жидкости и влаге передней камеры с выраженностью воспаления в переднем отрезке глаза при экспериментальном иммуногенном увеите [21–22]. Обнаружено, что повышение концентрации α2-МГ в сыворотке крови является фактором риска развития и тяжёлого течения увеита при олигоартикулярном ювенильном идиопатическом артрите [23].

Нами впервые проведено исследование широкого круга протеолитических ферментов и их ингибиторов в различных биологических жидкостях детей с эндогенными увеитами различной локализации, этиологии и активности воспалительного процесса, в также в группе сравнения.

Установлено, что активный воспалительный процесс сопровождается активацией протеолитических ферментов и их ингибиторов, что проявляется увеличением содержания УПА в слёзной жидкости, УПА, ММП-9 и ТИМП-1 во влаге передней камеры, а определение УПА в слёзной жидкости является одним из объективных критериев определения активности увеита.

У пациентов с панувеитами выявлено более высокое содержание ММП-9, ПГ и активность α2-МГ в слёзной жидкости, чем у детей с передними и периферическими увеитами, что, очевидно, отражает роль данных биомолекул в генерализации воспалительного процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые получены данные о роли системы протеолиза в патогенезе эндогенных увеитов у детей, имеющие важное научное и практическое значение.

Разработаны новые критерии оценки активности и тяжести увеита, основанные на определении протеолитических ферментов и их ингибиторов в слёзной жидкости. Полученные результаты могут быть использованы для разработки таргетной терапии.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом. Л.А. Катаргина — разработка дизайна и концепции исследования, окончательное одобрение вариант а статьи для опубликования; Н.Б. Чеснокова — разработка дизайна и концепции исследования, написание статьи; Е.В. Денисова — разработка дизайна исследования, обследование пациентов, редактирование статьи; М.А. Храброва, О.В. Безнос — сбор, обработка данных и их интерпретация, написание текста статьи.

ADDITIONAL INFO

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution. All authors confirm that their authorship complies with the international ICMJE criteria (all authors made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication). The largest contribution is distributed as follows: L.A. Katargina — development of the design and concept of the article, critical review of the article, final approval of the version of the article for publication; N.B. Chesnokova — development of the design and concept of the article, writing the text; E.V. Denisova — data analysis, examination of patients, database creation, writing the text; M.A. Khrabrova, O.V. Beznos — data collection, processing and interpretation, writing the text of the article.

作者简介

Lyudmila Katargina

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: katargina@igb.ru
ORCID iD: 0000-0002-4857-0374

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

俄罗斯联邦, Moscow

Natalya Chesnokova

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: khrabrovamaria@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7856-8005
SPIN 代码: 8705-7248

Dr. Sci. (Biology), Professor

俄罗斯联邦, Moscow

Ekaterina Denisova

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: deale_2006@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-3735-6249
SPIN 代码: 4111-4330

MD, Cand. Sci. (Medicine)

俄罗斯联邦, Moscow

Mariia Khrabrova

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

编辑信件的主要联系方式.
Email: khrabrovamaria@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9422-4264

MD, Junior Researcher

俄罗斯联邦, Moscow

Olga Beznos

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: khrabrovamaria@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7557-4955
SPIN 代码: 7894-5162

MD, Doctor of Clinical Laboratory Diagnostics

俄罗斯联邦, Moscow

参考

补充文件