Исследование функциональной роли консервативной последовательности на 5'-конце четвертого интрона гена mod(mdg4) в транс-сплайсинге у Drosophila melanogaster

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Альтернативный сплайсинг представляет собой важный механизм, обеспечивающий генетическое разнообразие белков. У Drosophila melanogaster были обнаружены уникальные локусы, где разнообразие мРНК возникает в результате транс-сплайсинга — процесса, при котором экзоны из различных пре-мРНК соединяются. Наиболее подробно исследован транс-сплайсинг в локусе mod(mdg4), который кодирует более 31 изоформы. Важными элементами для этого процесса являются ранее описанные консервативные последовательности в четвертом интроне. Целью данного исследования является дальнейшая характеристика консервативных мотивов четвертого интрона, а именно элемента на 5'-конце интрона. С помощью модельных трансгенных линий показано, что внесенные замены в последовательность изучаемого элемента приводят к нарушению транс-сплайсинга. Напротив, аналогичные изменения в эндогенном локусе не привели к нарушению транс-сплайсинга. Таким образом, консервативный элемент играет роль в транс-сплайсинге, но не является ключевым.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Ю. В. Солдатова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН)

Автор, ответственный за переписку.
Email: me@mtih.me
Россия, Москва

О. Бегинязова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН)

Email: me@mtih.me
Россия, Москва

П. Г. Георгиев

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН)

Email: me@mtih.me

академик РАН

Россия, Москва

М. В. Тихонов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН)

Email: me@mtih.me
Россия, Москва

Список литературы

  1. Wright C.J., Smith C.W.J., Jiggins C.D. Alternative splicing as a source of phenotypic diversity. // Nat Rev Genet, 2022, № 23(11): P. 697–710.
  2. Labrador M., Mongelard F., Plata-Rengifo P., et al. Protein encoding by both DNA strands. // Nature, 2001, № 409(6823): P. 1000.
  3. Horiuchi T., Giniger E., Aigaki T. Alternative trans-splicing of constant and variable exons of a Drosophila axon guidance gene, lola. // Genes Dev, 2003, № 17(20): P. 2496–501.
  4. Shi X., Singh S., Lin E., et al. Chimeric RNAs in cancer. // Adv Clin Chem, 2021, № 100: P. 1–35.
  5. Tikhonov M., Utkina M., Maksimenko O., et al. Conserved sequences in the Drosophila mod(mdg4) intron promote poly(A)-independent transcription termination and trans-splicing. // Nucleic Acids Res, 2018, № 46(20): P. 10608–10618.
  6. Gao J.L., Fan Y.J., Wang X.Y., et al. A conserved intronic U1 snRNP-binding sequence promotes trans-splicing in Drosophila. // Genes Dev, 2015, № 29(7): P. 760–71.
  7. McManus C.J., Duff M.O., Eipper-Mains J., et al. Global analysis of trans-splicing in Drosophila. // Proc Natl Acad Sci USA, 2010, № 107(29): P. 12975–9.
  8. Bonchuk A.N., Balagurov K.I., Baradaran R., et al. The Arthropoda-specific Tramtrack group BTB protein domains use previously unknown interface to form hexamers. // Elife, 2024, № 13.
  9. Melnikova L., Kostyuchenko M., Molodina V., et al. Multiple interactions are involved in a highly specific association of the Mod(mdg4)-67.2 isoform with the Su(Hw) sites in Drosophila. // Open Biol, 2017, № 7(10).
  10. Soldatova Iu., Shepelev M., Georgiev P., et al. A Novel Mechanism for Transcription Termination in the mod(mdg4) Locus of Drosophila melanogaster. // Biology (Basel), 2024 in press.
  11. Kaida D., Berg M.G., Younis I., et al. U1 snRNP protects pre-mRNAs from premature cleavage and polyadenylation. // Nature, 2010, № 468(7324): P. 664–8.
  12. Tikhonov M., Georgiev P., Maksimenko O. Competition within Introns: Splicing Wins over Polyadenylation via a General Mechanism. // Acta Naturae, 2013, № 5(4): P. 52–61.
  13. Bischof J., Maeda R.K., Hediger M., et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. // Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, № 104(9): P. 3312–7.
  14. Hernandez G., Vazquez-Pianzola P., Sierra J.M., et al. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. // RNA, 2004, № 10(11): P. 1783-–97.
  15. Zhang X., Koolhaas W.H., Schnorrer F. A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila. // G3 (Bethesda), 2014, № 4(12): P. 2409–18.
  16. Ozturk-Colak A., Marygold S.J., Antonazzo G., et al. FlyBase: updates to the Drosophila genes and genomes database. // Genetics, 2024, № 227(1).
  17. Crooks G.E., Hon G., Chandonia J.M., et al. WebLogo: a sequence logo generator. // Genome Res, 2004, № 14(6): P. 1188–90.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. (А) Структура локуса mod(mdg4) у Drosophila melanogaster. Аннотированные промоторы обозначены стрелками. Общие экзоны, присутствующие во всех изоформах, показаны зеленым цветом. Донорный сплайс-сайт, участвующий в транс-сплайсинге, располагается после 4 общего экзона (обозначен красным полукругом). Альтернативные экзоны, уникальные для конкретной изоформы, отображены оранжевым цветом (на одной и той же цепи ДНК) и фиолетовым цветом (на противоположной цепи). (Б) Выравнивание 5'-сплайс-сайта четвертого интрона и прилегающих к нему последовательностей с гомологичными участками других видов. Представлены последовательности семейства Drosophilidae и мух Musca_domestica, Glossina morsitans. (В) Лого представление мотива 5'СС всех интронов Drosophila melanogaster, полученный для актуальной аннотации генома D. melanogaster [16] и визуализированный с помощью WebLogo [17]. (Г) Изменения, внесенные в последовательность на 5'-конце интрона.

Скачать (162KB)
Метаданные
3. Рис. 2. (A) Схема модельной системы, предназначенной для исследования функциональной роли консервативного участка на 5'-конце интрона-4 гена mod(mdg4). “Донорная конструкция” (слева) включает промотор mod(mdg4) (обозначен стрелкой), кодирующую областью, состоящую из четырех общих экзонов (зеленые прямоугольники), IRES и интрон 4 (5'СС – красный полукруг, транскрибируемая часть интрона – красный градиент). “Акцепторная конструкция” (справа) содержит двунаправленный промотор изоформ Т и K (обозначены стрелками) и аутроны (серый) с 3’CC (красный полукруг) соответствующих изоформ. В результате транскрипции образуется донорный и два варианта акцепторных транскриптов. При транс-сплайсинге формируется два вида мРНК, состоящих из 5'-части донорного транскрипта и 3’-части акцепторных. Места отжига праймеров для анализа эффективности транс-сплайсинга обозначены стрелками под соответствующими транскриптами. (Б) Оценка эффективности транс-сплайсинга у гетерозигот донор/акцептор была проведена с помощью ОТ-кПЦР. Эффективность транс-сплайсинга оценивалась по соотношению количеств ампликонов из области соединения четвертого экзона и маркерного гена к двум генам домашнего хозяйства (Vha100-1, CG9067). Каждая комбинация трансгетерозигот была проанализирована не менее чем в трех повторностях. Планки погрешности отображают стандартные отклонения (n =3). Звездочки обозначают уровни значимости: ***P < 0.001.

Скачать (67KB)
Метаданные
4. Рис. 3. (А) Схема внесения изменений в эндогенный локус mod(mdg4). С помощью CRISPR/Cas9 вносится разрез в интроне-4 (пиктограмма ножницы). В качестве матрицы для рекомбинации использовали вектор с мутацией в одном из плечей (изменения в последовательности обозначены красным шрифтом). Для отбора трансформантов конструкция содержала флуоресцентный маркер mCherry, окруженный loxP-сайтами, благодаря которым этот ген удалялся Cre-рекомбиназой. Наблюдались два типа трансформантов – с мутацией (мутация-loxP) или с последовательностью дикого типа (wt-loxP). (Б) Оценка эффективности транс-сплайсинга у мух дикого типа и у гомозиготных линий с loxP-сайтом и с мутантным вариантом 5'-последовательности и loxP-сайтом. Эффективность транс-сплайсинга оценивалась по соотношению количеств ампликонов из области соединения четвертого экзона и альтернативных экзонов T, K, Z к двум генам домашнего хозяйства (Vha100-1, CG9067). Измерения для каждой линии были повторены не менее трех раз. Планки погрешности отображают стандартные отклонения (n =3).

Скачать (70KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025