Characteristics of antibody production to individual cytomegalovirus proteins in children with keratitis and uveitis

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Цитомегаловирус человека (ЦМВ — Human cytomegalovirus, HCMV), или вирус герпеса человека типа 5 (ВГЧ- 5 — Human Нerpesvirus 5, HHV-5), относится к семейству герпесвирусов (Herpesviridae), подсемейству бетагерпесвирусов (Betaherpesvirinae). ЦМВ широко распространён во всем мире, инфицирование происходит в любом возрасте, но преимущественно в раннем. ЦМВ — одна из основных причин перинатальных (внутриутробных, интрантальных и ранних постнатальных) инфекций. Внутриутробная инфекция эмбриона возможна в любом гестационном возрасте, причём симптоматика во многом зависит от времени заражения [1].

Первичное инфицирование ЦМВ (внутриутробное или после рождения) в большинстве случаев протекает бессимптомно, реже возникают клинически выраженные заболевания с вовлечением разных органов. Как и все герпесвирусы, после первичного заражения ЦМВ не элиминируется из организма человека, в результате возникает пожизненная персистирующая ЦМВ-инфекция (ЦМВИ), формы которой разнообразны. При латентной форме (наиболее распространённой) ЦМВ сохраняется в иммунокомпетентных клетках человека в неактивном состоянии. Основные очаги латенции — моноциты и их предшественники, эндотелиальные клетки сосудов микроциркуляторного русла, альвеолярные макрофаги, Т-лимфоциты и стромальные клетки костного мозга. Для хронической ЦМВИ характерна очень слабая репликация вируса без клинически выраженных очагов воспаления, но с длительным выделением ЦМВ во внешнюю среду с секретами и жидкостями организма. Возможна реактивация латентной ЦМВИ с интенсивной репликацией вируса и манифестацией болезни. ЦМВИ относится к оппортунистическим инфекциям, при которых латентный вирус легко реактивируется под влиянием многочисленных внешних и внутренних факторов (переохлаждение, травмы, стрессы, другие заболевания, иммуносупрессия).

В ответ на ЦМВ инфекцию в организме синтезируются специфические антитела. В начале первичной инфекции продуцируются противовирусные иммуноглобулины М (IgM), низкоавидные IgG-антитела, антитела к предраннему неструктурному антигену, затем их сменяют высокоавидные IgG-антитела к поздним структурным антигенам, сохраняющиеся в организме пожизненно в связи с постоянным присутствием вируса.

Как у всех герпесвирусов, вирион цитомегаловируса включает геном (линейную двухцепочечную ДНК), капсид (белковую оболочку, состоящую из 162 капсомеров, окружающих геном), наружную оболочку (суперкапсид) и тегумент (tegument)-матрицу (аморфный белковый слой, расположенный между капсидом и суперкапсидом). ЦМВ — самый крупный из герпесвирусов человека. Его геном кодирует синтез более 200 вирусных белков, среди которых различают структурные и неструктурные. Неструктурные белки активно участвуют в репродукции вируса, но не входят в состав зрелого вириона; структурные, напротив, формируют вирусные частицы (вирионы). Половина всех вирусных белков вириона содержится в тегументе, в основном в виде фосфопротеинов (рр). Большинство из них участвует во всех стадиях репродукции вируса (внедрение ЦМВ в клетку, экспрессия вирусных генов, синтез вирусных белков, сборка и выход вириона из клетки, уклонение от иммунной системы хозяина) [2].

Среди многочисленных фосфопротеинов тегумента ЦМВ очень важную роль в репродукции вируса, обеспечении ускользания вирионов от иммунной надзора хозяина и создании условий для пожизненного сохранения вируса в иммунном организме отводят главным белкам тегумента: рр 65, рр 150, рр28 [2].

Фосфопротеин рр65, основной компонент внеклеточных вирусных частиц, ингибирует распознавание иммунными клетками ранних вирусных белков ЦМВ, играет ключевую роль в уклонении от иммунной системы, прежде всего от врождённого иммунитета [3].

Фосфопротеин рр150 обеспечивает правильную сборку новых вирусных частиц в инфицированной клетке, по объёму он занимает второе место после рр65 [2].

Фосфопротеин рр28-регулирует выход вновь образованных вирионов из клетки, отличается высокой иммуногенностью [2].

Фосфопротеин рр52 — ДНК-связывающий белок ЦМВ, его также относят к предранним белкам, его роль в репродукции вируса активно обсуждается, хотя не вполне ясна [4].

Верификация ЦМВ-этиологии врождённого заболевания в отдалённые после родов сроки представляет определённые трудности, т.к. в этот период определение вируса в жидкостях и секретах организма может дать отрицательные результаты, хотя после внутриутробной инфекции вирус выделяется в течение длительного времени (6 и более месяцев). Серологические исследования позволяют уточнить наличие и стадию инфекции по спектру определяемых противовирусных антител. Антитела к ЦМВ класса IgM являются маркёрами первичной инфекции, IgG-антитела — к структурным антигенам-хронической инфекции, а IgG-антитела — к предранним неструктурным антигенам ЦМВ в сочетании с IgG-антителами — к структурным антигенам отражают реактивацию хронической инфекции.

Среди глазных проявлений приобретённой ЦМВИ чаще всего упоминают хориоретиниты, увеиты, ретиниты, особенно у иммуноуомпрометированных детей (с онкологическими заболеваниями, ВИЧ-инфекцией, получающих иммуносупрессивную терапию). Описаны тяжёлые ЦМВ- ретиниты у детей с ретинобластомой на фоне химиотерапии. Превентивная противовирусная терапия значительно снижала риск их развития [5], хотя реактивация хронической ЦМВИ с клинической манифестацией наблюдается чаще всего у иммуносупрессированных пациентов. Известны ЦМВ-заболевания глаз, развивающиеся у иммунокомпетентных взрослых и детей. Постоянно расширяется спектр заболеваний глаз, ассоциируемых с ЦМВИ. Так, у ребёнка трёх лет описан ЦМВ-кератит, который, по данным авторов, хорошо купировался противовирусной терапией, включающей системное назначение иммуноглобулина человека антицитамегаловирусного и ганцикловира в течение 21 дня [6].

При стандартной серодиагностике ЦМВИ с использованием ИФА нельзя уточнить, экспрессия каких вирусных антигенов обусловила выработку антител. Этот вопрос решается с помощью методов, выявляющих антитела к индивидуальным вирусным антигенам (иммуноблот, лайн-блот, вестерн-блот), что более точно, чем характеристика класса иммуноглобулинов, позволяет дифференцировать первичную, хроническую и реактивацию хронической инфекции и исключить ложноположительные результаты.

В литературе имеются данные о важной и неоднозначной роли каждого из белков тегумента ЦМВ в инфекционном процессе [2]. Обследование взрослых с патологией глазного дна выявило различную интенсивность синтеза антител к индивидуальным белкам ЦМВ у пациентов с возрастной макулярной дегенерацией и центральной серозной хориоретинопатией в условиях реактивации ЦМВ [7].

Цель. Определить особенности синтеза антител к белкам тегумента рр65, рр150, рр28 и ДНК-связывающему белку рр52 цитомегаловируса и сопоставить диагностическую эффективность двух лабораторных методов серодиагностики ЦМВИ у детей с увеитами и кератитами разного генеза: иммуноферментного анализа и линейного иммуноанализа.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Обследовано 30 детей, в том числе 16 детей с кератитами в возрасте от 4 до 16 лет (средний возраст 9,0 лет) и 14 детей с увеитами в возрасте от 13 месяцев до 17 лет (средний возраст 9,5 лет). Всем пациентам было проведено тщательное офтальмологическое обследование, при необходимости назначались консультации ревматолога, невролога, отоляринголога. У всех детей при обращении в институт брали кровь из локтевой вены. Сыворотки крови до постановки анализа хранились при -20℃.

Антитела к структурным антигенам и основному предраннему неструктурному антигену (IE) ЦМВ исследовали в иммуноферментном анализе (автоматический ИФА- анализатор Лазурит, США) с диагностическими наборами «Векто-ЦМВ-IgM», «Векто-ЦМВ-IgG» (AO «Вектор-Бест», Россия), «БиоСет-актив-ЦМВ» (АО БТК «Биосервис», Россия).

IgM- и IgG-антитела к структурным антигенам ЦМВ без уточнения их антигенной специфичности рассматривали как маркёры первичной и хронической инфекции, соответственно; IgG-антитела к основному неструктурному предраннему белку IE свидетельствовали о реактивации хронической ЦМВИ.

Одновременно с ИФА сыворотки исследовали методом линейного иммуноанализа (ЛИА, лайн-блот), определяли IgG-антитела к индивидуальным рекомбинантным антигенам (АГ) ЦМВ, полученным в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова: IE, р52, р150, р65, р28. Белки тегумента относятся к фосфопротеинам (рр). В ЛИА использовали рекомбинантные антигены р52, р150, р65, р28, полученные в бактериальной системе экспрессии и очищенные методами эксклюзионной и аффинной хроматографии. Рекомбинантные антигены содержали только высокоспецифичные для ЦМВ иммунодоминантные белковые фрагменты (р) вирусных антигенов.

Постановку ЛИА осуществляли следующим образом. Рекомбинантные антигены р52, р150, р65, р28 сорбировали на полосках нитроцеллюлозной мембраны в виде отдельных линий. В качестве отрицательного антигена использовали β-галактозидазу E.coli, контролем правильности проведения реакции служила иммунная сыворотка к IgG-человека. Детекцию образовавшегося комплекса «антитело-рекомбинантный АГ» проводили с помощью моноклональных антител мыши к Fab-фрагменту IgG- человека, конъюгированному с пероксидазой хрена.

Результаты оценивали визуально по интенсивности окрашивания линий (1+, 2+, 3+), проявляющегося после контакта с сывороткой пациента в области нанесения индивидуальных антигенов в сопоставлении с контрольными положительным и отрицательным антигенами.

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы Biostadt, определяли точный критерий Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ИФА. В ИФА обнаружена более высокая инфицированность ЦМВ детей с увеитами по сравнению с детьми с кератитами. IgG-антитела к поздним структурным ЦМВ- антигенам (маркёрам хронической инфекции) выявлены у 10 из 14 (71,4%) детей в группе с увеитами и у 6 детей из 16 (37,5%) — с кератитами (р >0.05).

Маркёры первичной инфекции — IgМ-антитела к поздним структурным антигенам ЦМВ в ИФА — не выявлены ни у одного из 30 обследованных детей. Серологические маркёры реактивации хронической ЦМВ-инфекции (ЦМВИ) — IgG-антитела к IE-антигену — определялись очень редко: у трёх из 10 детей с увеитами и у одного из 6 детей с кератитами. Уровень IgG-антител к IE- антигену у всех четырёх детей был низкий.

ЛИА. У серонегативных в ИФА пациентов антитела к отдельным исследованным антигенам ЦМВ в ЛИА не обнаруживались. Результаты анализа сывороток крови в ЛИА представлены в таблице.

 

Таблица. Частота выявления IgG-антител (линии с интенсивностью окрашивания 1+, 2+, 3+) к рекомбинантным антигенам ЦМВ у пациентов с увеитами и кератитами, хронически инфицированных ЦМВ (линейный иммуноанализ) / able. Detection rate of IgG antibodies (bands 1+, 2+, and 3+) to CMV recombinant antigens in CMV-infected patients with uveitis and keratitis and chronic CMVI (LIA)

Интенсив ность окраски полос Intensity of band staining	Обследовано (n) Total examined (n)		IE		p150		p52		p65		p28
	Увеиты Uveitis	Кератиты Keratitis	Увеиты Uveitis	Кератиты Keratitis	Увеиты Uveitis	Кератиты Keratitis	Увеиты Uveitis	Кератиты Keratitis	Увеиты Uveitis	Кератиты Keratitis	Увеиты Uveitis	Кератиты Keratitis
3+	10	6	0	0	3	2	1	0	1	1	3	0
2+			0	0	2	1	3	0	5	0	2	2
1+			2	1	2	1	0	2	4	4	3	2
2+ и 3+			0	0	5/10	3/61	4/10*1	01	9/102	1/62	5/10	2/6
							р <0.05		р <0.05
1, 2, 3+			2/10	1/6	7/10	5/6	4/10	2/6	10/10	5/6	8/10	4/6

* в знаменателе число обследованных пациентов, в числителе — число пациентов, серопозитивных к данному рекомбинантному антигену с интенсивностью окрашивания линий 2+ и 3+;^{- 1}р52 — р <0.05 ²р65 — р <0.05.

* in the denominator of patients seropositive for specific recombinant antigen and in the numerator of patients with detected bands with 2+ and 3+ staining intensity to specific recombinant antigen; 1р52, р <0.05; 2р65, р <0.05.

 

Антитела к IЕ-антигену выявлены в сыворотке только одного пациента с увеитом, у которого в ИФА также обнаружены антитела к этому белку. Достоверных различий в частоте определения антител к индивидуальным антигенам в целом (с любой интенсивностью окраски линий) в ЛИА между детьми с увеитами и кератитами не отмечено (р >0.05). Однако число детей с интенсивным антительным ответом (2+ и 3+) к р52 и р65 было достоверно выше у пациентов с увеитами по сравнению с больными кератитами (р <0.05).

ОБСУЖДЕНИЕ

ЦМВ играет важную роль при врождённой и приобретённой патологии органа зрения у детей. На клинические формы поражения глаз при внутриутробной инфекции влияет характер ЦМВИ (первичная или реактивация хронической), уровень вирусной нагрузки, сроки гестации и др. Часто манифестация последствий внутриутробной инфекции наступает спустя длительные сроки после рождения ребёнка. Иммуносупрессия способствует обострению хронической ЦМВИ. Описаны ЦМВ-ретиниты у детей с ретинобластомой на фоне химиотерапии. Причём авторы подчёркивают, что превентивная противовирусная терапия значительно снижала риск их развития [5]. Сообщается также о ЦМВ заболеваниях глаз у взрослых и детей вне иммуносупрессии.

Разнообразие клинических проявлений ЦМВ-заболеваний глаз при врождённой и постнатальной инфекции затрудняет их этиологическую диагностику без использования специальных лабораторных методов.

В практической медицине наиболее распространена серодиагностика методом твёрдофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Однако встречающиеся ложноположительные результаты на IgM-антитела, невозможность сравнения уровней IgG-антител при использовании тест-систем разных фирм-производителей обусловило необходимость разработки и применения иммуноблота в качестве подтверждающего теста. Иммуноблот позволяет дифференцировать антитела к отдельным вирусным антигенам. Формат иммуноблота с использованием в качестве антигенов нативного вирусного лизата (Western-Blot) менее чувствительный, чем формат линейного иммуноанализа (ЛИА, Line-Blot) с рекомбинантными антигенами ЦМВ. Исследование образцов сывороток в ЛИА позволяет исключить как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты, полученные в результате ИФА. Метод ЛИА является вариантом мультиплексного анализа и позволяет тестировать исследуемый образец сыворотки в одной реакции одновременно с несколькими антигенами. Преимущество его перед другими вариантами иммуноблота заключается в применении рекомбинантных вирусоспецифических антигенов в количествах, намного превосходящих их содержание в составе препаратов, полученных из цельных вирионов. К преимуществам ЛИА относится также возможность выявления антител к диагностически значимым белкам, которые присутствуют в составе цельновирионных препаратов в минорных количествах.

Антитела к IE-антигену (предраннему вирусному белку) — маркёры активной литической инфекции. Экспрессия предранних генов, кодирующих этот белок, запускает каскад последовательной экспрессии ранних и поздних генов, кодирующих структурные вирусные белки, и необходима для репликации ЦМВ.

У обследованных нами пациентов IgG-антитела к IE- антигену в ИФА обнаружили у трёх из 10 детей с увеитами и у одного ребёнка с кератитом в низком уровне. По результатам ЛИА наличие антител к IE-антигену подтвердили лишь у одного пациента с увеитом, остальные три ребёнка, серопозитивные в ИФА, в ЛИА оказались серонегативными. При этом ещё у одного ребёнка с увеитом в ЛИА выявили IgG-антитела к IE-антигену, хотя исследование в ИФА дало отрицательные результаты. Наличие маркёров реактивации ЦМВИ имеет важное клиническое значение, т.к. указывает на неблагоприятный фактор, который может ухудшать течение воспалительного процесса в глазу и потребовать коррекцию терапии. При слабоположительных результатах ИФА и при подозрении на реактивацию ЦМВИ имеются прямые показания для постановки подтверждающего теста (ЛИА) для предотвращения клинических ошибок.

Результаты обоих тестов совпали у ребёнка 16 лет с задним увеитом. Локализация воспалительного процесса в заднем отрезке глаза, высокий уровень IgG-антител к структурным антигенам ЦМВ в ИФА, выявленное в ЛИА интенсивное (окраска 2+-3+) антителообразование к индивидуальным белкам вируса: р52, р65 и р28, позволяет предположить у данного пациента реактивацию хронической ЦМВИ.

Фосфопротеин рр65 относится к мажорным белкам тегумента. Антитела к рекомбинантному антигену р65 обнаружены у большинства серопозитивных в ИФА детей, частота их выявления в обеих обследованных группах существенно не отличалась (увеиты 10 из10, кератиты 5 из 6 пациентов). Достоверное отличие между двумя группами наблюдалось в интенсивности антителообразования: у детей с увеитами преобладала окраска линий 2-3+, а при кератитах 1+ (р <0.05). Роль рр65 в жизненном цикле ЦМВ разнообразна. По-видимому, хроническая ЦМВИ более значима в патогенезе увеитов, чем кератитов, что сопровождается усиленной экспрессией рр65 в целях обеспечить вирусу защиту (уклонение) от иммунного надзора хозяина, в первую очередь, от врождённого звена иммунитета. Блокировать ряд противовирусных защитных механизмов и обеспечить персистенцию вируса в иммунокомпетентном организме — одна из основных функций рр65 [3, 7].

По результатам ЛИА интенсивное образование IgG- антител (2-3+) к р52, предраннему ДНК-связывающему белку ЦМВ, обнаружено у детей с увеитами и не выявлено у детей с кератитами (р <0.05), у которых наблюдалось только слабое антителообразование (1+). Роль рр52 в репликативном цикле ЦМВ не до конца ясна. Некоторые авторы рассматривают IgM-антитела к р52 у взрослых пациентов с синдромом хронической усталости как маркёры активной ЦМВ-инфекции [4]. Нельзя исключить, что у детей с увеитами интенсивное антителообразование к р52 также отражало реактивацию вируса. Однако этот вопрос требует дальнейших исследований.

Существенных различий в частоте и интенсивности образования антител к остальным исследованным антигенам тегумента мы не обнаружили, что может быть в определённой степени связано с малочисленностью групп.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инфицированность ЦМВ детей с увеитами почти в 2 раза выше, чем детей с кератитами (10/14–71% vs 6/16–37,5%, р >0.05). Хотя различия статистически не достоверны, что возможно связано с ограниченным числом обследованных, они отражают более важную роль ЦМВ в этиопатогенезе увеитов по сравнению с кератитами.

В ЛИА выявлено также повышение частоты (р >0.05) и интенсивности (р <0.05) антителообразования к рекомбинантным индивидуальным вирусным антигенам р65 и р52 при увеитах по сравнению с кератитами, что, по-видимому, отражает важную роль ЦМВИ в патогенезе увеитов.

Сравнительный анализ определения IgG-антител к IE-антигену вируса в ИФА и ЛИА выявил несовпадение результатов в 4 из 30 (13%) образцах сывороток. Серологические маркёры реактивации хронической ЦМВИ (IgG-антитела к IE-антигену) у детей с офтальмопатологией имеют важное клиническое значение, т.к. могут служить основанием для назначения противовирусной терапии. Наши данные свидетельствуют о целесообразности использования линейного иммунного анализа в качестве подтверждающего теста в подобных случаях.

Таким образом, лабораторное исследование сывороток в ИФА с последующим анализом антител к индивидуальным рекомбинантным антигенам ЦМВ в ЛИА — эффективный высокочувствительный и высокоспецифичный способ верификации ЦМВ-инфекции и определения её активности. При обследовании детей с воспалительной офтальмопатологией наиболее информативными оказались результаты определения антител к предраннему неструктурному белку (IE) и двум антигенам тегумента: рр52 и рр65.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

ADDITIONAL INFO

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

About the authors

Galina I. Krichevskaya

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Author for correspondence.
Email: gkri@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7052-3294
SPIN-code: 6808-0922

MD, PhD

Russian Federation, 14/19, Sadovaya-Chernogriazskaya street, Moscow, 105062

Lyudmila A. Katargina

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: katargina@igb.ru
ORCID iD: 0000-0002-4857-0374
Scopus Author ID: 137428

MD, Dr. of Sci. (Med.), professor

Russian Federation, 14/19, Sadovaya-Chernogriazskaya street, Moscow, 105062

Galina I. Alatortseva

I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: gkri@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9887-4061
SPIN-code: 8911-3000

PhD (Biology)

Russian Federation, Moscow

Vera V. Dotsenko

I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: gkri@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5866-944X
SPIN-code: 9250-0131

PhD (Biology), Senior Researcher

Russian Federation, Moscow

Lyubov N. Nesterenko

I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: gkri@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3825-3906
SPIN-code: 6819-7980

PhD (Chemistry)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files